江苏省棉花黄萎病菌的培养特性及致病力分化监测

对2008年来自江苏的37个棉花黄萎病菌菌株进行了培养特性及致病性分化监测。根据在PDA培养基上生长时形成微菌核的多少,菌株可分为3种培养类型,其中菌核型占54.1%,菌丝型占24.3%,中间型占21.6%。菌核型上升成为主要的培养类型,并且出现了初分离培养时,菌落特征为完全黑色微菌核的菌膜菌核型菌株。采用特异性引物(D-1/D-2和ND-1/ND-2)PCR检测菌株的致病类型,结果落叶型菌株占83.8%,非落叶型菌株占16.2%,显示目前江苏省棉花黄萎病菌以落叶型菌株为主,并且在每个植棉市都有分布。苗期致病力测定表明江苏省棉花黄萎病菌存在明显的致病力分化,其中致病力强的菌株占27.0%,中等的占40.5%,弱的占32.4%,并且在落叶型和非落叶型群体中都存在致病力强、中、弱的菌株。

棉花黄萎病菌致病力分化与ISSR遗传变异分析

从新疆北部石河子棉区分离纯化得到15个棉花黄萎病菌菌系,对其生物学培养特征、致病力、致病类型以及ISSR遗传变异进行了分析。菌株培养特征表明,在供试15个菌株中,菌丝型菌株最多,其次是菌核型,中间型最少,3种类型分别占60%,26.7%,13.3%。以2个棉花品种为寄主,室温人工接种鉴定菌株的致病力,结果表明,供试菌株存在明显的致病力分化,按照平均病情指数将供试菌株划分为强、中、弱3个类型,分别占73.3%,26.7%,0%。特异性引物(ND1/ND2和D1/D2)PCR检测结果显示,供试菌系中落叶型菌系有5个,占33.3%,非落叶型菌系有10个,占66.7%,其中落叶型菌株的平均致病力高于非落叶型。菌株ISSR指纹分析表明供试菌株间遗传变异较大,进一步分析发现,ISSR遗传分化与致病力具有一定的相关性。研究结果还发现,菌株XJ-1和XJ-6遗传相似系数在99%以上,但其致病力存在明显差异;同一病株上存在不同菌落形态和致病力的2个菌株XJ-8-1和XJ-8-2,但遗传相似系数在95%以上,这都充分表明了新疆石河子棉花黄萎病菌致病力分化与遗传变异关系的复杂性,为棉花黄萎病抗病育种以及综合防治提供了重要的理论参考。

培养条件对棉花黄萎病菌毒素产生的影响

研究查彼克培养基中大丽轮枝菌（ＶｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅＫｌｅｂ．）菌株在光照、温度、ｐＨ值、振荡通气等条件下产生毒素的情况。结果表明：每日光照１２～２４ｈ、ｐＨ值为７、２６～２８℃、全天振荡通气是产生毒素的适宜培养条件，其中振荡培养较静止培养下产生毒素的浓度提高近两倍，且培养１４ｄ病原菌产毒量占培养１７ｄ的９０．２５％，接近最高值，是产毒培养较适宜的时期。

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库的构建及其表型分析

以棉花强致病力黄萎病菌株V592为材料,利用农杆菌介导的T-DNA插入技术构建了一个含15000个转化子的突变体库,对突变体的生物学特性、致病力及T-DNA插入拷贝数进行研究,结果显示:(1)突变体的菌落形态分为菌核型、中间型、菌丝型和菌膜型,分别占92.12%,4.54%,3.19%和0.15%;(2)菌核型、中间型和菌丝型菌株,在菌落生长速度和孢子大小方面无明显差异;而在产孢量方面,菌核型普遍强于中间型和菌丝型;(3)致病性测定显示,菌核型的致病力普遍强于中间型和菌丝型;(4)Southern杂交显示,T-DNA单拷贝数插入的突变体比率约为70.99%,而菌核型的单插入率为80.00%,明显高于中间型(69.23%)和菌丝型(64.71%)。以上结果表明,农杆菌介导转化技术可用于棉花黄萎病菌突变体库的快速构建,突变体的菌落表型与其产孢能力、致病力及T-DNA插入拷贝数等之间存在一定的相关性。

4种木霉菌对棉花黄萎病菌抑制作用的测定

以绿色木霉(Trichoderma viride)、康氏木霉(Trichoderma koningii)和二株未知木霉菌株(Trichoderma spp.)为供试木霉菌株,采用对峙培养法测定了不同温度处理下对棉花黄萎病菌(Verticilliam dahliae)的拮抗作用。结果表明,木霉在不同温度下对棉花黄萎病菌的抑制作用不一,其中以30℃和25℃黑暗条件下木霉对棉花黄萎病菌菌丝生长的抑制作用最强,对峙培养5d后,绿色木霉、康氏木霉和二株未知木霉菌在30℃条件下对棉花黄萎病菌的抑制率分别达到67.3%、65.9%、56.8%、65.9%,25℃条件下的抑制率分别为65.9%、72.9%、65.9%、78.8%;20℃下木霉菌株对棉花黄萎病菌的抑制作用次之,10℃、15℃和35℃条件下木霉菌丝扩散速度较慢,且孢子产生量少,不能有效地抑制棉花黄萎病菌菌丝的扩展,表明环境温度过高或过低对木霉菌丝的生长及分生孢子的产生均有较大影响。该研究为筛选棉花黄萎病菌更为有效的生防木霉菌株提供理论依据。

滤纸片法筛选不同活性物对棉花黄萎病菌抑制效果研究

为了筛选对棉花黄萎病菌有效的活性物。采用滤纸片测定了52种活性物对棉花黄萎病菌的抑制效果。试验结果的记载由分级记载法和160倍显微图片表示。结果表明,筛选出了14种对棉花黄萎病菌抑制效果显著的活性物。该研究为筛选对棉花黄萎病菌高效活性物及田间防治棉花黄萎病提供理论依据。

25种中草药提取物对棉花黄萎病菌的抑制作用

以棉花黄萎病菌Verticillium dahliae为供试菌种,采用菌丝生长速率法测定了25种中草药乙醇提取物的抑菌作用。结果表明,25种中草药乙醇提取物中,花椒、黄柏和木香的抑菌作用最好,抑制率分别为59.30%、48.29%和45.54%。同时,这3种中草药的乙醇提取物抑菌活性均显著高于石油醚提取物的抑菌活性。在室内毒力测定中,花椒、黄柏和木香的乙醇提取物对供试菌株的EC_(50)分别为3.74,13.98和17.02 mg/mL。

土壤中落叶型棉花黄萎病菌的分子检测方法

为了建立快速、准确检测土壤中落叶型棉花黄萎病菌的方法,本试验将提取自落叶型棉花黄萎病菌菌株V991的DNA稀释成不同浓度,同时提取在灭菌土中接入不同数量的V991孢子后制成的人工病土中的DNA,并采用五点取样法提取自然土样中的DNA,选用落叶型黄萎病菌的特异性巢式PCR引物,对上述DNA样品进行检测。结果显示:采用巢式PCR法可检测到落叶型棉花黄萎病菌菌株V991的DNA浓度为1×10-4 mg/L,同时每克人工病土中含有10个V991孢子也可被检测到,该方法灵敏性比常规PCR法提高2～5个数量级。用该方法对所取自然土样进行检测,均可检测到落叶型棉花黄萎病菌的存在。

新疆棉花黄萎病菌病原种群监测研究

采用致病性测定、营养亲和群测定及PCR特异性扩增3种方法,对新疆棉区采集的35个棉花黄萎病菌代表性菌系进行致病型鉴定。结果表明,新疆棉花黄萎病菌存在强、中、弱3种不同的致病类型,其中以中等致病类型居多。利用营养亲和群方法将新疆棉花黄萎病菌分为2个亲和群,其中1个亲和群中的所有菌系均与标准落叶型菌系相亲和,另1个亲和群中的所有菌系均与标准非落叶型菌系相亲和。利用棉花黄萎病菌落叶型特异引物进行PCR特异性扩增,有3个菌系扩增出550bp的落叶型黄萎病菌特异性片段。用营养亲和群及PCR特异性扩增均进一步证实目前新疆存在落叶型黄萎病菌菌系。

新疆主要棉区棉花黄萎病菌致病力分化及其遗传多样性分析

测定了源于新疆棉区的22个棉花黄萎病菌单孢菌株和3个落叶型棉黄萎病菌菌株T9、VD8和V151对4个棉花品种上的致病力。采用随机引物聚合酶链反应（RAPD）技术分析了这些菌株的遗传多样性。结果表明：供试的25个棉花黄萎病菌之间的致病力存在显著差异（P〈0．05）。在各棉花品种上，22个新疆菌株中都有与T9、VD8或V151的致病力差异不显著的菌株，说明新疆存在较强致病力的棉花黄萎病菌菌系。RAPD分析表明，供试的8个随机引物中6个可以从25个菌株的基因组DNA中稳定地扩增出多态性DNA片段。对扩增片段统计结果表明，供试菌株间遗传相似系数变化幅度为0．57—1．00。聚类分析表明，在阈值0．625处可将25个菌株分为4个RAPD群（命名为RG1、RG2、RG3和RG4）。RG1包括2个菌株，即B、BL-19菌株；RG2包括5个菌株，即BL-17、BL-13、N-5、H、N-16；RG3为最大一个亚群，包括19、SL等16个菌株；RG4包括2个菌株，即VD8和V151。综合分析表明新疆棉花黄萎病菌的致病力强弱和菌株的采集地等遗传背景存在一定的差异，这可能与各主产棉区的频繁引种有着直接的联系。

正交设计优化棉花黄萎病菌ISSR-PCR反应体系

采用正交试验设计方法,对ISSR的影响因素进行研究,从Taq酶、Mg2+、dNTP和引物4因素3水平进行优化试验,筛选并建立了适合棉花黄萎病菌的ISSR-PCR最佳反应体系,即25μL的反应体系中含有1×PCR buff-er,200μmol/L dNTP,0.75μmol/L引物,150 mmol/L Mg2+,1U TaqDNA聚合酶和40 ng模板DNA。

化学农药对棉花黄萎病菌和生防菌的选择毒性

研究了11种化学农药对棉花黄萎病菌和生防菌的选择毒性。对棉花黄萎病菌CV-1的毒力测定结果表明，浓度100μg／g具明显抑制效果的有多菌灵、苯菌灵、甲基硫菌灵和粉锈宁；5000μg／g下具抑制作用的有菌核净和五氯硝基苯。苯并咪唑类杀菌剂对绿色木霉LTR．2的毒性最高，多菌灵、苯菌灵和甲基硫菌灵的EC50值依次为0．7395、1．6784和0．7370μg／g。多菌灵、苯菌灵和甲基硫菌灵对黄萎病菌的最低抑制浓度分别为0．7、2．3、2．6μg／g；对LTR-2最低抑制浓度分别为1．2、3．4、6．4μg／g。多菌灵对几种生防真菌的毒性选择性比值（TSR）介于1～10之间的有LTR-2、2-②、Tc、Tk7a、GLR，分别为4．6、3．1、4．7、1．2和7．3，为正向调控作用；介于10～100之间的有Sxb，其TSR为27．5，为中度选择性；大于1000的有菌株T9，其TSR值为9145．0，为强烈正向调控作用。苯菌灵的TSR值介于1～10之间的有Sxb、2-②、Tc、Tk7a、GLR，依次为2．8、3．9、5．6、4．5和4．7；介于10～100之间的有LTR-2和1、9，其TSR为13．7和66．5；没有大于100的生防菌菌株。

棉花黄萎病菌遗传多样性的ISSR分析

【目的】利用ISSR分子标记技术,对不同地理来源的棉花黄萎病菌株进行分子指纹分析,以了解其遗传关系。【方法】选用25条引物,对来自于我国11个省(市、自治区)的28个棉花黄萎病菌株进行分子指纹分析,研究各菌株间的遗传相似性。【结果】从25条ISSR随机引物中筛选出9条多态性好、条带稳定的引物,用其对28个棉花黄萎病菌株进行扩增,共获得1 989条谱带,其中1 908条为多态性条带,多态性比率为95.9%,表明ISSR标记对棉花黄萎病菌具有较高的多态性;通过对棉花黄萎病菌ISSR遗传相似系数的统计与分析,得到其相关系数r=0.88,该r值介于0.8和0.9之间,表明进化树符合较好,故将ISSR标记应用于棉花黄萎病菌的遗传多样性分析,具有较高的一致性和可信度。ISSR多态性与棉花黄萎病菌的落叶型有一定的相关性,而与菌落形态类型、地理来源未表现出相关性。【结论】供试的不同地理来源的棉花黄萎病菌株遗传相似性较高,基因多样性较低,且ISSR多态性与地理来源未表现出相关性。

新疆棉花黄萎病菌的培养特性及致病性分化的研究

1996～ 1 999年对采自新疆各地的 30个菌株进行了培养特性及致病性分化的研究。查明新疆棉花黄萎病不仅在培养特性上存在明显区别 ,在致病性上也存在强、中、弱三种不同的类型。过去检查新疆棉花黄萎病一般属于致病性较弱的类型 ,而这次通过鉴别寄主反应及多感染塔什干 1、2号品种 。

棉花黄萎病菌拮抗细菌的分离、筛选及鉴定

采用稀释平板法从健康棉花根部土壤中分离得到细菌菌株1520株。通过室内平板多次筛选获得25株对棉花黄萎病菌具有强拮抗抗作用的细菌菌株。25个拮抗细菌温室盆栽防治黄萎病的试验结果表明:2株拮抗细菌在防治棉花黄萎病中表现较好的防病效果,其中868菌株的防治效果为67.3%。根据2个菌株的培养特征和生理生化特性,初步鉴定868菌株为Pseudomonas fluorescens,112菌株为Bacillus megatherium。

拮抗链霉菌Men-myco-93-63及其发酵液对棉花黄萎病菌生长的影响

本研究采用抑菌圈法和菌落生长法测定桔抗链霉菌 Ｍ ｅｎ－ｍｙｃｏ－ ９３－ ６３（５２３）及其发酵液对棉花黄萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）Ｔ－９和河北省强致病力菌株Ｖ－ｈ菌体生长的影响。结果表明：链霉菌Ｍｅｎ－ｍｙｃｏ－９３－６３及其发酵液对棉花黄萎病菌菌体具有强烈的抑制作用，明显降低了棉花黄萎菌的生长量。同时发现，拮抗链霉菌及其发酵液对不同致病菌株表现不同的抑菌效果；Ｍｅｎ－ｍｙｃｏ－９３－６３发酵稀释液可使Ｖ．ｄａｈｌｉａｅ出现融菌现象。

棉花黄萎病菌gDNA提取方法和不同单孢的RAPD分析

选用棉花黄萎病菌代表性的菌系 Ｖａ（ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏａｔｒｕｍ 的一个菌株） 和 Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ 的落叶型菌系 Ｖ Ｄ－８ ， Ｔ９ 及非落叶型菌系 Ｊｙ（ 致病力较强的泾阳菌系） ，以 Ｋｅ（ 致病力较弱的库尔勒菌系） 作为实验对象，研究了 Ｃ Ｔ Ａ Ｂ 和氯化苄２ 种提取方法的优劣．结果表明： Ｃ Ｔ Ａ Ｂ 法比氯化苄法提取的 Ｄ Ｎ Ａ 片段长（５０ｋｂ） ，纯度高（ Ｏ Ｄ２６０／ Ｏ Ｄ２８０ ＝ １５６） ，且稳定、无污染，适合于常规分子生物学研究；该提取方法中 Ｅ Ｄ Ｔ Ａ， Ｎａ Ｃｌ 和β巯基乙醇的最佳配比为１０ ｍ ｍｏｌ，１４ ｍｏｌ 和２ ％ ．利用提取的５ 个菌系的ｇ Ｄ Ｎ Ａ 对 Ｏ Ｐ Ｙ 及 Ｏ Ｐ Ｂ 两组引物进行了筛选，１６ 个引物可以扩增出多态性的谱带．利用引物对 Ｖａ 菌系的４ 个单孢进行的 Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 分析，从分子水平证明了不同单孢之间发生变异的可能性．

棉花黄萎病菌菌丝生长和产孢量的影响因素研究

研究不同温度、pH值以及碳源、氨源对棉花黄萎病菌菌丝生长速率和分生孢子产生量的影响。结果表明，在0-33℃以，供试菌株均能生长，最适温度为25℃；在pH值为3-10时均能生长，最适pH值为5-8；葡萄糖作为碳源时，该病菌在培养基平板上生长最快，分生孢子的产生量最大；氨源以硝酸钠为最佳，其次为脲。硫酸铵作为氨源时菌丝生长速率低于无氨源对照，菌落不形成微菌核，产孢量小，这说明硫酸铵为氨源时不利于病菌菌丝生长及微菌核和分生孢子的形成。

石河子地区棉花黄萎病菌致病型监测研究

对石河子地区采集的黄萎病菌代表性菌系进行生物学特性及致病性分化研究,结果表明：棉花黄萎病菌菌落形态为圆形,大多数菌落的中央为白色棉絮状的菌丝而较凸起,供试菌系均可形成微菌核;病菌在15-30℃条件下均可生长,最适生长温度为25℃,超过33℃则不能生长,对高温具有一定的耐受性;依据鉴别寄主法测定结果,石河子地区的棉花黄萎病菌可分为中、弱2种致病型,其中以弱致病类型为主。

木霉菌对棉花黄萎病菌拮抗的作用

以绿色木霉(Trichodermaviride)、康氏木霉(Trichodermakoningii),以及二株未知种名的木霉菌株(Trichodermaspp.)为供试菌,采用对峙培养测定其对棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)的抑制作用,并研究了四种木霉菌产生的非挥发性代谢物对菌丝干重的影响。结果表明:在对峙培养中,木霉菌对棉花黄萎病菌均有明显抑制作用,木霉菌产生的非挥发性代谢物可以强烈抑制棉花黄萎病菌生长,明显降低其菌丝干重,并具有热稳定性。光学显微镜下观察,木霉菌丝在棉花黄萎病菌丝上平行或波浪式生长且棉花黄萎病菌丝出现细胞原生质浓缩和菌丝断裂等现象。