内生镰刀菌CEF-321对棉花黄萎病的防治作用及机理

为了明确棉花内生镰刀菌CEF-321对棉花黄萎病的防治作用及机理,采用对峙培养法、对扣培养法、圆盘滤膜培养法测定CEF-321对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)强致病力菌株Vd080菌丝生长的抑制作用;在温室内采用滤液灌根接种法和固体菌剂基质接种法测试CEF-321对棉花黄萎病的防治效果,测定其对棉花叶片中胼胝质合成的诱导,利用逆转录聚合酶链反应检测相关防御基因的表达。结果表明,CEF-321的挥发性和非挥发性代谢物对Vd080菌丝的生长有明显的抑制作用;CEF-321固体菌剂基质接种和滤液灌根接种对棉花黄萎病的防治效果分别为39.08%和53.30%;CEF-321可诱导棉花叶片中胼胝质积累,诱导苯丙氨酸解氨酶基因PAL、过氧化物酶基因POD、病程相关蛋白基因PR10等上调表达。这些研究结果初步表明CEF-321有用于棉花黄萎病生物防治的潜力。

转录因子GhWRKY41促进水杨酸合成增强棉花对黄萎病菌的抗性

棉花是我国最重要的经济作物之一,但其产量和品质受黄萎病菌危害而大幅度下降。挖掘棉花黄萎病抗性相关基因并解析其分子机制,对加快棉花抗黄萎病育种进程具有重要意义。前期研究鉴定到一个在多个抗病棉花品种中均受黄萎病菌诱导显著上调表达的WRKY基因GhWRKY41,该基因通过激活苯丙烷代谢增强棉花对黄萎病菌的抗性。本研究进一步分析了GhWRKY41在不同激素处理下的诱导表达模式,利用病毒介导的基因沉默(VIGS)技术验证了GhWRKY41的抗病功能,并利用前期已创制的GhWRKY41转基因棉花株系‘Jin668’测定了其内源植物抗病激素含量。结果显示,GhWRKY41受水杨酸(SA)、Me-JA和H_(2)O_(2)诱导均显著上调表达;GhWRKY41被沉默后可削弱棉花对黄萎病菌的抗性;SA含量在GhWRKY41超表达棉花中显著增加,而在GhWRKY41干涉棉花中则明显减少。RT-qPCR分析显示,SA合成基因GhSID2及SA信号转导基因GhNPR1、GhPR1、GhPR5的表达水平在超表达植株中明显上调,而在干涉植株中则显著下降。ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因试验结果表明,GhWRKY41可结合并激活GhSID2、GhPR1和GhPR5的表达。此外,外施SA可明显提高棉花的黄萎病抗性。综上表明,GhWRKY41可通过促进棉花中内源植物激素SA的合成来增强植株的黄萎病抗性,这一结果完善了GhWRKY41在棉花抵御黄萎病菌过程中的生物学功能,为未来利用黄萎病抗性基因创制棉花抗病材料提供了理论基础。

黄萎病对棉花根内细菌组成和群落构建的影响

大丽轮枝菌是一种土传半活体营养型植物病原真菌,其引起的黄萎病是影响我国乃至世界棉花生产的最主要因素之一。植物根内微生物种类繁多,对病原菌有重要的抵御作用。但目前对于病原菌感染影响植物根内微生物组成和群落构建的生态机制尚缺乏深入了解。本研究通过结合可培养和不可培养技术,研究了健康棉花植株和患黄萎病棉花植株根内细菌物种组成、多样性和群落构建的变化。结果发现,发病棉花根际细菌群落多样性与健康菌株相比无显著变化,但是物种组成发生了显著改变,表现为变形菌门、拟杆菌门与厚壁菌门相对丰度的增加和放线菌门、疣微菌门与粘菌门相对丰度的减少。在所有检测到的4579个zOTU中, 83%的zOTU是两个处理共有的,但是它们的相对丰度在两个处理中发生了较大变化,这是引起根内细菌群落变化的主要因素。指示物种分析(ISA)结果显示,健康棉花植株根内富集了假单胞菌属、红环菌科、莫拉氏菌科等类群,而患病植株根内富集了假单胞菌属、贪噬菌属和丛毛单胞菌科的物种和根癌农杆菌等。在两组处理的棉花根内均检测到了大丽轮枝菌的拮抗菌ABLF-8菌株,但其相对丰度在患病植株中显著低于健康植株。Beta-NTI和beta零模型分析结果显示确定性过程主导了棉花根内微生物群落的构建,但是其贡献在患病植株中显著降低,说明患病植株根内微生物群落组成的随机性更强。以上结果说明,大丽轮枝菌侵染直接或间接地降低了棉花对根内微生物群落构建的影响,引起了大丽轮枝菌拮抗菌相对丰度的显著降低,从而导致根内微生物菌群的失衡,降低了根内微生物群落对大丽轮枝菌的拮抗能力,这可能是棉花黄萎病进一步发展的重要作用机制之一。

外源添加L-脯氨酸对棉花黄萎病发生及其根际土壤微生物群落的影响

【目的】根系分泌物是植物与土壤微生物进行互作的信号媒介,对于植物病害发生和植株生长均具有重要调控功能。论文旨在明确棉花根系分泌物L-脯氨酸抵御棉花黄萎病发生的微生态机制,揭示L-脯氨酸介导的根际微生物与棉花黄萎病发生的互作关系,为构建生物防治土传病害的有益菌群提供新视角。【方法】通过温室盆栽试验,以外源添加不同浓度的L-脯氨酸(0、50、100、200和400 mmol·L^(-1))为试验处理,采用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)和宏基因组测序技术分别测定不同处理的土壤中大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)DNA拷贝数量和土壤微生物群落结构及功能,采用主成分分析比较不同处理的根际土壤微生物群落结构,利用冗余分析研究土壤养分因子与微生物群落结构的相关性,利用斯皮尔曼相关分析研究微生物群落结构功能代谢途径的相关性。【结果】与空白对照相比,低浓度(50 mmol·L^(-1))L-脯氨酸处理不能够减轻棉花黄萎病的发生,高浓度(100、200和400 mmol·L^(-1))L-脯氨酸处理的病情指数分别下降22.51%、60.23%和64.23%。qPCR结果表明,L-脯氨酸处理不能够显著降低土壤中大丽轮枝菌拷贝数量。宏基因组测序分析表明,L-脯氨酸处理后细菌多样性Shannon指数显著增加,真菌多样性Shannon指数呈下降趋势。在属水平上,L-脯氨酸处理后类诺卡氏菌属(Nocardioides)、溶杆菌属(Lysobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、Phycicoccus、假单胞菌属(Pseudomonas)和毛霉菌属(Mucor)的相对丰度呈上升趋势。线性判别分析表明,除浓度为100 mmol·L^(-1)的L-脯氨酸外,外源添加L-脯氨酸处理后根际土壤微生物KEGG通路的富集情况发生改变。冗余分析表明,细菌群落组成受pH、电导率、硝态氮、铵态氮和有机质显著影响,而真菌群落组成与铵态氮存在显著相关性。Spearman相关分析表明,细菌的KEGG代谢通路与pH、有机质、铵态氮含量呈负相关关系,而与电导率和硝态氮呈正相关关系;真菌的大部分KEGG代谢通路与土壤养分的相关性较差。【结论】外源添加适量L-脯氨酸通过改变土壤细菌群落结构和功能,增加有益微生物的相对丰度,从而影响棉花黄萎病的发生,但其不能够改变病原菌数量。同时,根际细菌群落组成和功能均与土壤养分存在相关性。

北疆棉花黄萎病发病率调查及土壤中黄萎病菌微菌核数量与种群类型分析

为了解北疆棉花黄萎病的发生情况及发病与土壤中黄萎病菌微菌核数量的关系和病原菌种群类型,2021年对北疆石河子、奎屯、博乐等8市(县)棉田棉花黄萎病发病率、土壤中黄萎病菌的微菌核数量、菌株种群类型进行了抽样调查。结果表明,北疆未发生棉花黄萎病的棉田占49.2%,0%<发病率<5.0%的棉田占32.7%,发病率≥5.0%的棉田占18%。与2013年、2015年相比,2021年无病田率分别增加17.7和12.7百分点,发病率≥5%的棉田分别减少15.7和21.6百分点。从棉田黄萎病发病率与土壤中微菌核数量的关系来看,整体上北疆棉田棉花黄萎病发病率与微菌核数量相关性不显著(r=0.1191);分区域看,石河子沙湾片区、奎屯乌苏片区、精河博乐片区棉田黄萎病发病率与微菌核数量的相关系数分别为0.0332、0.0076、0.0623,均无显著相关性;而呼图壁玛纳斯片区棉田黄萎病发病率与微菌核数量的相关系数为0.6357,呈中度正相关。土壤中的黄萎病菌菌株以菌核型为主,占57.9%,菌丝型占23.2%,中间型占18.9%。用特异性引物进行PCR检测表明,土壤中黄萎病菌落叶型菌株占97.6%,占绝对优势。本研究将为北疆棉区棉花黄萎病的综合防控提供理论依据。

棉花抗黄萎病相关基因GhERF020功能的初步分析

黄萎病(Verticillium wilt)是影响我国棉花产量和品质的重要病害,其病原菌是大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)。AP2/ERF类转录因子在植物生长发育和胁迫适应性响应中的作用日益突显。为挖掘棉花抗黄萎病相关基因并探究其生物学功能,利用拟南芥抗大丽轮枝菌相关基因AT1G22810.1,同源比对获得棉花抗黄萎病候选基因GhERF020(XM_016842745.1)。生物信息学分析结果表明,GhERF020开放阅读框的长度为441 bp,编码147个氨基酸;其蛋白含有1个保守的AP2结构域,相对分子质量为16.16 kD,无跨膜结构,属于亲水蛋白;预测其启动子区域含有水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸等响应元件。基因表达模式分析发现,GhERF020受大丽轮枝菌侵染诱导表达。亚细胞定位分析表明,GhERF020蛋白定位于细胞核中。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术下调GhERF020表达后,棉花植株对大丽轮枝菌的敏感性显著增强,病情指数和病原菌生物量明显升高。由此表明,GhERF020是棉花抗黄萎病的正向调控因子。

菌糠对棉花黄萎病及棉花根际微生物群落组成的影响

【目的】评价菌糠对棉花黄萎病的防治效果(防效),明确菌糠对棉花根际微生物群落的影响。【方法】通过温室盆栽试验及田间小区试验评价香菇菌糠对棉花黄萎病的防效;利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测棉花根际大丽轮枝菌数量;利用宏基因组测序及生物信息学分析棉花根际微生物群落和功能基因组成。【结果】土壤中添加2%(质量分数)的菌糠对棉花黄萎病的温室防效达到76.8%。添加菌糠后棉花根际大丽轮枝菌数量较空白对照减少81.02%。添加菌糠后棉花根际微生物中微杆菌属(Microbacterium spp.)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium spp.)、梨形孢属(Serendipita spp.)、毛壳菌属(Chaetomium spp.)等有益微生物丰度显著上升;同时,添加菌糠还改变了棉花根际细菌和真菌的共现模式,在提高细菌物种间关联性的同时降低真菌物种间关联性。利用京都基因和基因组数据库功能注释发现,菌糠处理后棉花根际微生物ABC转运蛋白(ko02010)、双组分调节系统(ko02020)、群体感应(ko02024)等涉及细菌信号识别和定植的基因相对丰度显著提高。在河北和新疆,菌糠对棉花黄萎病的田间防效最高分别为36.84%和43.98%。【结论】菌糠能够有效防治棉花黄萎病并降低棉花根际大丽轮枝菌数量,同时可改变棉花根际微生物群落和功能基因组成。

新特锐菌对棉花枯、黄萎病的防控试验研究

以新特锐菌为对象,研究其单用与混用对棉花枯、黄萎病的防控效果。结果表明:新特锐菌第2次施药后47 d的防效均高于80%,第2次施药后83 d的防效有明显下降,防效在65.4%以上,单产在413 kg;混用处理防效高达92.1%,第2次施药后83 d,防效高于66.6%,单产在420 kg;由此从防效及产量分析,推荐生产上可将新特锐菌与培经混用防棉花枯黄萎病效果较好。

棉花不同抗性品种根系分泌物分析及其对黄萎病菌的影响

对 7个不同抗黄萎病性能的棉花品种根系分泌物进行了收集和测定 ,结果发现抗病品种根系分泌物对病菌的孢子萌发和菌丝生长有一定的抑制作用 ,而感病品种根系分泌物则能刺激病菌生长。感病品种分泌物中氨基酸含量和种类较多 ,而且苯丙氨酸、脯氨酸等仅出现在感病品种的分泌物中 ;抗病品种根系分泌物中糖类物质含量亦明显低于感病品种。

河北省棉花黄萎病菌致病性的研究

在棉花苗期采用塑料营养钵底部定量注菌液法接种，于昼温２５～２６℃，夜温２０～２２℃的人工培养室中测定了自河北省重点植棉县分离的４０个棉花黄萎病菌单孢菌系和外地５个菌系的致病性。以中棉石系亚、海岛棉海７１２４、陆地棉９３抗１２、辽棉５号、冀棉１１号、农大３６５６个品种为鉴别寄主，以病情指数作为划分抗、感类型的标准，根据在鉴别寄主上的反应，４５个供试菌系可被划分为致病力强的Ⅰ型、致病力中等的Ⅱ型和致病力弱的Ⅲ型，分别占５３．５％、２８．９％、１７．８％。Ⅰ型菌系除使中棉表现抗（耐）病外，海岛棉和陆地棉均表现感病。该类菌系遍布冀中南棉区，其中有７个菌系可使部分品种表现落叶，证明河北省已有落叶型菌系存在。试验还表明，海７１２４、９３抗１２、冀棉１１号和农大３６５４个棉花品种对黄萎病鉴别力较强。

利用拮抗细菌防治棉花黄萎病

从棉花根围和根内分离到 17个供试菌株在平板对峙培养中 ,都能极显著抑制VerticilliumdahliaeKleb(简称Vd)的生长 ,其中 15株的抑菌率大于 6 5 % ,最高达 89.6 %。这些菌株的培养滤液也对Vd的生长有抑制作用。对供试细菌的防病及棉花出苗安全性所作的盆栽试验结果表明 ,13个菌株对棉花出苗表现安全 ;10个菌株防治棉花黄萎病效果极显著 ,其中 4株 (ICB 18、NCD 2、CS 2 5和CS 2 7)的防治效果达 72 .3%～ 81.4 % ;3株 (C 94、C 2 8和NCD 2 5 )的防治效果达 5 5 .7%～ 6 1.9% ,而且这 7株对棉花出苗都安全。田间试验结果表明 ,在这 7个菌株中 ,菌株NCD 2能够极显著地防治棉花黄萎病 ,防治效果为 78.1% ;另外 4株 (ICB 18、CS 2 5、C 94和C 2 8)能显著降低黄萎病病情指数 ,防治效果达 37.1%～ 4 7.3%。

北方植棉区棉花黄萎病菌生理分化类型研究

通过对采自北方植棉区落叶和非落叶病株的５１个棉花黄萎病菌系致病力分化测定结果，确定我国北方植棉区存在落叶类强致病力菌系；混合类中度致病力菌系及非落叶类弱致病力菌系的３个致病类型，并分别占测试菌的４１．５１％、３５．８５％和２２．６４％，其中９个强致病菌系致害棉苗出现落叶程度与对照菌的落叶程度相当或略重，表明河北、山东、河南植棉区重病田有落叶型黄萎菌系。病菌培养性状研究，得出３个培养型，即黑色菌落型、灰白色菌落型与白色菌落型。明确了黄萎病菌生长最佳温度为２５℃，这一结果同田间黄萎病大发生要求的温度一致。

防治棉花黄萎病的生防细菌NCD-2的田间效果评价及其鉴定

生防细菌NCD-2是自棉花根围土壤分离到的一株细菌菌株,田间小区试验表明:NCD-2菌株对棉花黄萎病的防治效果2年平均为85.4%,3年大区示范防病效果为51.2%～60.6%,并且该生防细菌对棉花产量和产量构成因子(单铃重、衣分、衣指、籽指等)及纤维品质(绒长)有所提高和改善.同时,本文测定了NCD-2对主要大田作物的安全性,证明其对小麦、玉米、棉花、马铃薯、黄瓜、茄子和大豆7种作物没有致病性,并且对这些作物的出苗、生长和发育没有不良影响.应用API50 CH和API20 E细菌鉴定试剂盒,将NCD-2鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Cohn.).

根际微生物多样性与棉花品种对黄萎病抗性的关系研究 II.不同抗性品种根际真菌区系分析及其对棉花黄萎病菌的抑制作用

对棉花抗黄萎病品种（春矮早和８６－ ６）和感病品种（中棉１７和豫棉１２）的根际真菌区系进行了分析。结果表明每个品种都有自己独特的根际微生物区系，抗病品种根际微生物种数多于感病品种，区系组成更为复杂。抗病品种根际真菌优势种主要是漆斑菌 （Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ）、粘帚霉（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ）、曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）和青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ）等，感病品种则多为头孢霉（Ｃｅｐ ｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ）、镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ）、矛束孢（Ｄｏｒａｔｏｍｙｃｅｓ）、粘帚霉（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ）和漆斑菌（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ）等。采用平板对峙培养法测定了不同抗性棉花品种根际真菌区系各成员对棉花黄萎病菌的抑制作用，发现抗病品种根际真菌区系中对黄萎病菌具有抑制作用的真菌种数和比率都高于感病品种，而且抗病品种根际真菌的优势种对棉花黄萎病菌的抑制作用较强。这种差异在苗期和现蕾期更为明显，花铃期则显著减小。研究结果表明棉花品种对棉花黄萎病的抗性与根际真菌区系组成及其对黄萎病菌的抑制能力有一定关系。

棉花枯萎、黄萎病拮抗芽孢杆菌的抗菌蛋白特性

从土贝母和腊肠等中药和发酵食品中筛选出对棉花枯萎、黄萎病菌有广谱拮抗作用的芽孢杆菌29株,其中有12株菌产抗菌蛋白。有5株抑菌活性较强:H110、H184、H216、B316和B382。经初步鉴定,H110和H184为枯草芽孢杆菌,H216、B316和B382为地衣芽孢杆菌。5株菌的蛋白粗提液对热稳定,对蛋白酶K、胰蛋白酶均不敏感,但H184、H216的蛋白粗提液对胃蛋白酶部分敏感。

枯草芽孢杆菌BS菌株和哈茨木霉TH-1菌株对棉花枯黄萎病菌的拮抗作用

棉花枯萎病和黄萎病(简称枯、黄萎病)均是棉花主要病害,且均属土壤传播的维管束病害,防治上有很大难度,目前主要采取选育选用抗病品种为主的综合治理措施。然而由于迄今尚缺乏理想的高抗丰产品种和有效药剂,且化学药剂对环境污染问题日益突出,生物防治日益受到重视。关于拮抗菌对棉花枯、黄萎病菌的生防作用已有一些研究,但同时针对棉花枯、黄萎病开展的研究则鲜有报道。鉴于安徽棉区两病混发,且以枯萎病为主,作者就枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS菌株和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)TH-1菌株对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的拮抗作用及其机制进行了研究,以期为开发兼治两病的生防制剂提供必要的试验依据。

内生菌防治棉花黄萎病机理

将从棉株体内分离获得的内生菌Ala、73a接入棉花黄萎病菌菌株JC1B(落叶型)、BP2(非落叶型)的Czapek培养液中,培养不同时间后提取粗毒素,用考马氏亮兰G250法测定浓度,结果表明:对BP2产毒素抑制最强的为Ala菌体,抑制率达5197%;对JC1B产毒素能力抑制最强的是73a菌体,抑制率为7260%。同时,Ala、73a的代谢物对JC1B、BP2的产毒素和菌丝生长亦有明显的抑制作用。加入内生菌或代谢物后,其黄萎病菌毒素粗提液对棉苗致萎度下降。内生菌株处理棉种对出芽有促进作用,其中73a菌株的促进作用略强。

哈茨木霉TH-1对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的拮抗机制研究

采用平板对峙法、杯碟法和显微观察法研究了哈茨木霉(Trichoderma harzianum)TH-1菌株对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的拮抗作用及其机制。结果表明,哈茨木霉TH-1菌株与病菌对峙培养以及在培养基中加入TH-1菌株孢子悬浮液,对供试棉花枯、黄萎病菌均有较好的抑制效果;但TH-1菌株的代谢液对棉花黄萎病菌的抑制效果较差,对枯萎病菌几乎无抑制效果;显微观察发现,TH-1菌丝与枯、黄萎病菌的菌丝平行生长、产生附着胞结构附着于病菌菌丝上,或穿透病菌菌丝使病菌菌丝发生裂解。上述结果说明,哈茨木霉TH-1对供试棉花枯、黄萎病菌的拮抗机制主要是营养和空间竞争及重寄生作用。

棉花黄萎病拮抗细菌LC-04菌株的抗菌蛋白产生条件研究

LC-04菌株是从棉花叶部组织中分离出的一株类芽孢杆菌,其发酵液上清液的硫酸铵沉淀物对大丽轮枝菌V-190菌株的生长具有明显的拮抗作用,实验证明发酵液中含有蛋白质类抗菌物质。LC-04菌株的适宜发酵条件为:在pH7的LBG培养基中于30℃,180 r.min-1摇床振荡培养48 h,用70%硫酸铵对LC-04菌株发酵液上清液进行盐析,可以沉淀最多的抗菌蛋白。