棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒HaSNPV orf101的原核表达及抗体制备

[目的]摸索棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒(HaSNPV)orf101编码蛋白原核表达条件并制备其多克隆抗体。[方法]根据HaS-NPVorf101序列,设计引物,引入适当的酶切位点,利用PCR扩增出基因片段并将其克隆至pGEM-TEasy载体,然后亚克隆至原核表达载体pGEX-KG,检测在不同条件下融合蛋白的表达产量及其折叠性质。原核表达产物经SDS-PAGE分离纯化,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。[结果]在IPTG诱导的条件下,融合蛋白GST-HA101可在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达,表达产物的大小为55.8 kDa。制备的多克隆抗体经1∶8 000倍稀释后用于Western Blot分析,获得特异性显色信号。[结论]原核表达蛋白及其多克隆抗体的获得为深入研究Ha101的基因功能打下了基础。

中红侧沟茧蜂对棉铃虫核型多角体病毒的传播作用

中红侧沟茧蜂Microplitis mediator与核型多角体病毒(nucleopolyhedrovirus, NPV)是棉铃虫Helicoverpa armigera的两种重要生物防治因子。中红侧沟茧蜂传播NPV对于利用二者协同防治棉铃虫具有重要意义。本研究探讨了给中红侧沟茧蜂饲喂含病毒蜂蜜水、体表喷洒病毒液、中红侧沟茧蜂在染毒宿主体内产卵、从染毒宿主体内发育、蜂茧浸泡病毒5种带毒方式的传播病毒效率,以及饲喂带病毒蜂蜜水方式下的传播机制。结果表明,饲喂带病毒蜂蜜水和体表喷洒病毒时中红侧沟茧蜂传毒率较高,在连续传毒的3 d内传毒效率分别为15.1%、9.1%~9.3%、2.4%~4%,其他3种方式传毒效率较低。在田间防治时可以利用中红侧沟茧蜂的传毒作用采用病毒与寄生峰的协同防控策略。

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒几丁质酶基因的克隆与表达

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒 (HaSNPV)几丁质酶基因的序列 ,设计引物 ,引入适当的酶切位点 ,利用PCR扩增出不含N末端信号肽以及C末端内质网定位肽的几丁质酶基因片段。将该基因片断克隆至原核表达载体 pProEXHTb ,经IPTG诱导 ,在大肠杆菌DH5α中获得了高效表达 ,表达产物的大小为 6 0kD ,含量占菌体总蛋白量的 4 0 %。利用来源于AcMNPV几丁质酶的抗体对表达蛋白进行检测 ,获得特异性的显色信号 。

棉铃虫多核衣壳型多角体病毒fp25 K基因的克隆及分析

[目的]克隆棉铃虫多核衣壳型多角体病毒(HearMNPV) fp25 K基因,为深入研究杆状病毒的进化机制提供依据。[方法]通过半补齐法建立HearMNPV的质粒基因组文库,对插入片段进行鉴定和序列分析获取HearMNPV fp25 K基因。[结果]HearMNPV fp25 K基因的读码框由588个核苷酸组成,编码195个氨基酸;该基因上游具有晚期调控保守序列ATAAG,是一个晚期表达基因;HearMNPV fp25 K存在5个α-螺旋,8个β-折叠;HearMNPV与蓓带夜蛾核型多角体一致性最高,达97.0%,与舞毒蛾多核衣壳型多角体的FP’同源性最低,仅为19.3%。HearMNPV与GroupⅠNPVs、GroupⅡNPVs及GVs的fp25K同源基因间氨基酸平均相似性分别为55.6%、69.4%和29.3%,推测其与Ⅱ类NPVs的亲缘关系较近。[结论]该研究为杆状病毒分子进化、生物防治奠定了基础。

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)Hind III-L片段的序列分析

本文报道了棉铃虫单核衣壳核多角体病毒 (Helicoverpaarmigerasingle nucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HaSNPV)基因组的HindIII L片段的全序列。该片段全长 2 6 35bp ,包括 5个有意义的开放阅读框 :HaSNPVORF2 2 7,晚期表达因子 10基因 (lef10 ) ,vp10 5 4基因 ,Ac5 5 (AcMNPVORF5 5的同源基因 ) ,Ac5 6 (AcMNPVORF5 6的同源基因 )。与其它 6种杆状病毒的氨基酸序列比较表明 ,HaSNPV的lef10基因与甜菜夜蛾核型多角体病毒 (SeMNPV)的同源性最高 ,为6 4 % ,与冷杉毒蛾核型多角体病毒 (OpMNPV)的同源性最低 ,为 4 3% ;HaSNPV的vp10 5 4基因与SeMNPV的同源性最高 ,为 6 5 % ,与OpMNPV的同源性最低 ,为 4 9%。序列比较表明 ,HaSNPV的LEF10与VP10 5 4蛋白与其它 6种杆状病毒具有相同的保守区和亮氨酸拉链 (leucinezipper)

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒3个bro基因的原核表达与抗体制备

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)基因组全序列,设计引物,用PCR的方法扩增得到bro-a、bro-b和bro-c三个全长基因。将这三个基因的片段分别克隆至原核表达载体pProExHTb,经IPTG诱导,在E.coli DH50菌株中得到了目的基因的高效表达。表达的目的蛋白大小分别为32kDa、64kDa和58kDa,经SDS-PAGE分离纯化,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。抗体经1∶2500倍稀释后用于WestemBlot分析,获得特异性显色信号,所制备的三种抗体适合用作bro基因的功能的进一步研究。

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒组织蛋白酶基因的序列分析和进化研究

对棉铃虫单核衣壳核多角体病毒 (HaSNPV)的组织蛋白酶 (ν cath)基因进行了序列分析 ,此基因编码区长 10 98bp ,预计编码一个 36 6个氨基酸的蛋白产物。序列分析表明 ,HaSNPV的V CATH蛋白与其它杆状病毒的同源蛋白具有相似的保守结构并保留有相同的酶活性位点 ,根据已知的杆状病毒组织蛋白酶序列构建了ν cath基因的进化树 ,发现HaSNPV的ν cath位于NPV组中一个单独的分枝 ,结合ν cath基因在棉铃虫病毒基因组中的位置与其它NPV有较大不同 ,推测HaSNPV的ν cath基因可能拥有特殊的进化历程。

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒解螺旋酶基因的序列分析

对棉铃虫单核衣壳核多角体病毒 (Helicoverpaarmigerasingle -nucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HaSNPV)基因组中EcoRI N片段进行序列分析 ,获得了完整的解螺旋酶基因 (hel) ,其开放阅读框大小为 376 2bp ,编码一个分子量为 14 6kD的蛋白质。在hel起始密码子ATG上游 5 0位有强晚期启动子转录起始信号ATAAG ,在 112位和 189位存在两个TATAbox ,但未发现早期转录信号CAGT。其在终止密码子下游第 12位有一PolyA终止信号AATAAA。在其它真核或原核解螺旋酶中存在的 7个保守基元 (I、Ia、II、III、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ) ,只有 5个 (I、Ia、II、III、Ⅳ)在杆状病毒中保守同源性比较发现 ,HaSNPV解螺旋酶的氨基酸序列与甜菜夜蛾核多角体病毒 (SpodopteraexigueMNPV ,SeMNPV)的解螺旋酶具有最高的同源性 (6 6 % ) ,与Xestiac nigrum颗粒体病毒 (XcGV)解螺旋酶的同源性最低 (43% )。

棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析

棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析王根张传溪贡成良金伟吴祥甫（中国科学院上海生物化学研究所，上海２０００３１）关键词棉铃虫，核型多角体病毒，多角体蛋白基因，核苷酸序列，同源性棉铃虫Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉ...

核型多角体病毒对棉铃虫酯酶和酚氧化酶活性的影响

对感染核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis,NPV)的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)幼虫血淋巴进行了酯酶和酚氧化酶电泳分析。结果表明:2种酶带在感染12 h后其活力发生了明显变化;酯酶酶带2 d后发生位移,酚氧化酶酶带5 d发生位移,且各自建立新的酶系统。酚氧化酶比活力分析结果表明:感染NPV后,1 d达到最高点,2～3 d处于最低点,4 d后回升。

PCR法证实棉铃虫核型多角体病毒对棉铃虫经卵和蛹的垂直传播

根据棉铃虫核型多角体病毒的多角体蛋白基因设计 5’引物和 3’引物 ,通过PCR技术成功扩增 389bp的目的片段 ,并对该片段进行了克隆和测序。结果表明 ,扩增片段为棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白基因序列。该检测方法的灵敏度为 1 0fg,应用此技术从带毒的虫卵和蛹的总DNA中也检测到该病毒的存在。

棉铃虫核型多角体病毒与化学杀虫剂和卵磷脂混用的增效作用

棉铃虫核型多角体病毒 (HaNPV)分别与三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、灭净菊酯、灭多威、辛硫磷、甲基对硫磷和乙酰甲胺磷等化学杀虫剂混合饲喂棉铃虫幼虫 ,统计致死中浓度LC50 ,计算增效比 ,测定虫体内与抗性有关的三种重要酶 :多功能氧化酶 (MFO)、羧酸酯酶 (CarE)、乙酰胆碱酯酶 (AChE)的活性。研究大豆卵磷脂对HaNPV致病性的影响。结果表明 :HaNPV与化学杀虫剂混合饲喂抗性棉铃虫 ,生测统计增效比均大于 1 0 ,特别是病毒与甲基对硫磷混用 ,增效比更是达到 3 53,表现出良好的增效作用。混剂感染抗性棉铃虫 ,虫体内MFO的活性比化学杀虫剂单用时降低 3～ 12倍 ,CarE和AChE的活性也比化学杀虫剂单用时低 ,HaNPV明显抑制了化学杀虫剂对MFO和CarE的诱导作用。HaNPV与大豆卵磷脂混用 ,提高了HaNPV对棉铃虫的感染致死率 ,缩短了致死中时间 (LT50 )。

棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶的原核表达及其协同增效作用

【目的】在大肠杆菌中表达棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒(HearNPV)几丁质酶(Chi A),利用表达产物进行病毒增效作用研究,以明确杆状病毒Chi A对HearNPV的协同增效作用。【方法】用PCR方法扩增出不含N端信号肽编码序列的Chi A基因片段,分别克隆至原核表达载体pMAL-p2x和pET-32a中,构建重组表达载体,并分别在大肠杆菌TB1和BL21(DE3)中进行融合表达,测定融合蛋白对HearNPV的增效作用。【结果】克隆的基因片段经过测序后连接表达载体,成功构建了重组表达载体pMAL-p2x-Chi A和pET-32a-Chi A。重组载体转化相应菌株并进行诱导表达,发现pMAL-p2x-Chi A在大肠杆菌TB1中的表达量占细菌总蛋白的15.8%,其中20.0%为可溶性表达;pET-32a-Chi A在BL21(DE3)中的表达量占细菌总蛋白的26.8%,其中30.2%为可溶性表达。选用pET-32a-Chi A在BL21(DE3)中的表达产物作为增效蛋白,当表达的可溶性HearNPV Chi A的添加水平为1.0μg/mL时,其能够显著提高病毒毒力,棉铃虫的死亡率较对照提高36.6%。【结论】利用大肠杆菌表达的可溶性HearNPV Chi A,对HearNPV具有明显的增效作用。

科云牌棉铃虫核型多角体病毒生物农药的规模化生产和应用

昆虫病毒生物农药是纯天然无公害生物农药产品,本文介绍了中国科学院动物研究所同河南省济源白云实业有限公司合作,成功开发并商业化棉铃虫病毒生物农药的基本情况。我们开发的棉铃虫病毒生物农药注册商标"科云牌",包括两个产品:科云牌5 000亿PIB/g棉铃虫病毒原粉和科云牌600亿PIB/g棉铃虫病毒水分散粒剂。原粉产品已出口到欧洲,制剂产品用于棉铃虫防治,2006至2007年在棉田累计推广应用10万hm^2次。

中国棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶基因的定位与克隆

以α３２ＰｄＡＴＰ标记含ＣｆＭＮＰＶ几丁质酶基因的重组质粒为探针，在６８℃条件下对棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，将ＨａＳＮＰＶ的几丁质酶基因分别定位在ＢａｍＨＩＥ、ＢｇｌⅡＥ、ＥｃｏＲＩＧ、ＨｉｎｄⅢＦ、ＸｂａＩＨ、ＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩＩＭ和ＢａｍＨＩ＋ＸｂａＩＨ，并以ｐＴＺ１９Ｒ为载体获得了ＸｂａＩＨ片段克隆。

棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白聚集体特性及与其它包涵体蛋白的血清学关系

纯化的多角体碱解释放多角体蛋白 ,经等电点沉淀和柱层析对多角体蛋白进行分离纯化 ,结合SDS PAGE、免疫双向扩散、免疫电镜等方法 ,证明棉铃虫核型多角体病毒 (HaNPV)的多角体蛋白以聚集体形式存在。用ELISA法检测包涵体蛋白之间的血清学关系 ,结果表明 ,与黄地老虎颗粒体病毒 (AsGV)和粘虫颗粒体病毒 (PsGV)颗粒体蛋白相比较 ,HaN PV多角体蛋白与葡萄天蛾核型多角体病毒 (ArNPV)和黄地老虎核型多角体病毒 (AsNPV)

中国棉铃虫核型多角体病毒不同基因型的虫体克隆

首次利用虫体克隆技术，对野生型中国棉铃虫核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶＷ）的不同基因型进行了分离纯化。以较低浓度的ＨａＳＮＰＶＷ感染三龄初中国棉铃虫幼虫，病毒致死幼虫单虫收集，分别提取相应的病毒核酸，进行限制性内切酶分析，得到了ＨａＳＮＰＶ的七个不同基因型（ＨａＳＮＰＶＧ１至Ｇ７），其ＥｃｏＲＩ酶切图谱均不相同。用ＢａｍＨＩ酶切分析，七个基因型的酶切图谱只在一个片段上有显著区别：Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４ＤＮＡ的ＢａｍＨＩｈ片段大小是３．３０ｋｂ，Ｇ５、Ｇ６的这一片段的大小为３．５ｋｂ，而Ｇ７的这一片段为２．７ｋｂ。结果表明，野生型ＨａＳＮＰＶ至少包含七个不同的基因型。

中国棉铃虫核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析

应用谷实夜蛾核型多角体病毒（ＨｚＳＮＰＶ）ＤＮＡ聚合酶基因ＨｉｎｄⅢ／ＰｓｔⅠ３５９６ｂｐ片段作探针，经Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交，克隆了中国棉铃虫核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）完整的ＤＮＡ聚合酶基因，大小约为３．４ｋｂ。限制性内切酶分析表明，ＨａＳＮＰＶＤＮＡ聚合酶基因限制性内切酶图谱与ＨｚＳＮＰＶ相似。用双脱氧链终止法测定该基因部分核苷酸序列（８０５ｂｐ），推导出编码区２０６ａ。序列同源性比较显示，ＨａＳＮＰＶＤＮＡ聚合酶与ＨｚＳＮＰＶ之间具有高度的同源性；与ＬｄＭＮＰＶ、ＡｃＭＮＰＶ、ＢｍＳＮＰＶ。

棉铃虫（Heliothisspp）核型多角体病毒四个分离株的比较研究

本文从形态结构、生物活性、结构多肽、核酸限制性内切酶图谱和核酸同源性等方面对棉铃虫核型多角体病毒四个分离株（两个ＳＮＰＶ分离株：ＨａＳ、ＨｚＳ，和两个ＭＮＰＶ分离株：ＨａＭ１、ＨａＭ２）进行了比较研究。它们对中国棉铃虫二龄末三龄初幼虫的ＬＤ５０佰依次为３６１、３８７、２６３３、３５６０ＰＩＢｓ／克饲料，当感染剂过为５×ｌ０３ＰＩＢｓ／克饲料时，其ＬＴ５０值依次为４．６、４．９、６．４和６．６天。两个ＳＮＰＶ分离株的生物活性显著高于两个ＭＮＰＶ分离株。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，四个分离株多角体蛋白均为一条带，两个ＭＮＰＶ分离株结构多肽均具有相同的迁移率，两个ＳＮＰＶ分离株的结构多肽图谱也颇相似，但ＳＮＰＶ与ＭＮＰＶ分离株之间带型相差较大。各分离株基出组经ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ和ＸｂａＩ消化后，得到的内切酶图谱表现为两个ＮＭＰＶ分离株一致，两个ＳＮＰＶ分离株也很相似，而ＳＮＰＶ与ＭＮＰＶ分离株之间相差很大。严格条件杂交结果表明：两个ＳＮＰＶ分离株的基因组有较高的同源性，而ＳＮＰＶ与ＭＮＰＶ基因组之间的同源性极低。

中国棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒多角体蛋白基因的序列分析

以AcMNPV的多角体蛋白基因为探针，定位了中国棉铃虫单粒包理核型多角体病毒（HaSNPV）的多用体蛋白基因。序列测定表明，HaSNPV的多角体蛋白基因编码区为738个核苷酸，编码246个氨基酸，预计蛋白质分子量为29kDa。同源性分析表明，HaSNPV与美洲棉铃虫单粒包理核型多角体病毒（HzSNPV）具有最高的同源性，在整个阅读框架中只有4个碱基的差异，其中第179位碱基的变化导致唯一的氨基酸变化，这种变化并未导致其二级结构的改变。此外，两种病毒该基因的启动子结构也完全一样。HaSNPV与其它的SNPV和MNPV的同源性明显要低。结果预示HaSNPV与HzSNPV可能为同种病毒的不同变种。