PCR法证实棉铃虫核型多角体病毒对棉铃虫经卵和蛹的垂直传播

根据棉铃虫核型多角体病毒的多角体蛋白基因设计 5’引物和 3’引物 ,通过PCR技术成功扩增 389bp的目的片段 ,并对该片段进行了克隆和测序。结果表明 ,扩增片段为棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白基因序列。该检测方法的灵敏度为 1 0fg,应用此技术从带毒的虫卵和蛹的总DNA中也检测到该病毒的存在。

科云牌棉铃虫核型多角体病毒生物农药的规模化生产和应用

昆虫病毒生物农药是纯天然无公害生物农药产品,本文介绍了中国科学院动物研究所同河南省济源白云实业有限公司合作,成功开发并商业化棉铃虫病毒生物农药的基本情况。我们开发的棉铃虫病毒生物农药注册商标"科云牌",包括两个产品:科云牌5 000亿PIB/g棉铃虫病毒原粉和科云牌600亿PIB/g棉铃虫病毒水分散粒剂。原粉产品已出口到欧洲,制剂产品用于棉铃虫防治,2006至2007年在棉田累计推广应用10万hm^2次。

棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶的原核表达及其协同增效作用

【目的】在大肠杆菌中表达棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒(HearNPV)几丁质酶(Chi A),利用表达产物进行病毒增效作用研究,以明确杆状病毒Chi A对HearNPV的协同增效作用。【方法】用PCR方法扩增出不含N端信号肽编码序列的Chi A基因片段,分别克隆至原核表达载体pMAL-p2x和pET-32a中,构建重组表达载体,并分别在大肠杆菌TB1和BL21(DE3)中进行融合表达,测定融合蛋白对HearNPV的增效作用。【结果】克隆的基因片段经过测序后连接表达载体,成功构建了重组表达载体pMAL-p2x-Chi A和pET-32a-Chi A。重组载体转化相应菌株并进行诱导表达,发现pMAL-p2x-Chi A在大肠杆菌TB1中的表达量占细菌总蛋白的15.8%,其中20.0%为可溶性表达;pET-32a-Chi A在BL21(DE3)中的表达量占细菌总蛋白的26.8%,其中30.2%为可溶性表达。选用pET-32a-Chi A在BL21(DE3)中的表达产物作为增效蛋白,当表达的可溶性HearNPV Chi A的添加水平为1.0μg/mL时,其能够显著提高病毒毒力,棉铃虫的死亡率较对照提高36.6%。【结论】利用大肠杆菌表达的可溶性HearNPV Chi A,对HearNPV具有明显的增效作用。

棉铃虫核型多角体病毒orf80多克隆抗体的制备

从HearNPV G4株基因组中克隆得到orf80基因的全序列,将该基因构建于pMAL-c4E载体并在TB1中融合表达,orf80融合表达蛋白分子质量为73.3ku,与预测的蛋白一致,Western blot验证正确。纯化融合蛋白后制备抗原并注射新西兰大白兔从而得到orf80的多克隆抗体,经ELISA检测其效价达到2.56×105,表明该抗体具有较高的免疫原性,可用于orf80编码蛋白的检测及蛋白互作等相关研究。

中国棉铃虫核型多角体病毒VHA_(273)原毒株及其克隆株的比较研究

本文从形态结构、生物活性、核酸限制性内切酶图谱、结构多肽等方面对中国棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)VHA273多粒包埋型原毒株及其单粒包埋型克隆株H9进行了比较研究.它们对中国棉铃虫三龄初幼虫的LC5o值分别为2.987×104PIBs/mL和1.647×104PIBs/mL当感染剂量为2×107PIBs/mL时,其LT5o值分别是4.866d和4.797d.两个毒株的生物活性差别不大.经SDS-PAGE分析,两毒株结构多肽图谱带型相差较大.两毒株基因组经EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ,Hind Ⅲ和Xba Ⅰ消化后,得到的内切酶图谱表现为两毒株间有差别.这些差异的发现将有助于从分子水平揭示多粒包埋病毒和单粒包埋病毒形成原因.

棉铃虫核型多角体病毒ORF44基因的序列分析及原核表达

棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)ORF44是一个功能未知的基因,研究对HearNPV ORF44基因的序列及原核表达进行了初步研究。结果表明,HearNPV ORF44基因全长1 137 nt,编码378aa,预测编码蛋白分子量为42.7 ku。序列分析显示,ORF44具有双相启动子特征序列,同时兼有杆状病毒早期和晚期基因转录启动子特征序列。ORF44的推导氨基酸序列中含有1个强跨膜螺旋区域,32个磷酸化位点和4个糖基化位点。除HzNPVORF45外,未发现与ORF44氨基酸同源性高于30%的基因。构建了pET-44表达载体,并在大肠杆菌BL21中得到了高效表达,表达的融合蛋白分子量为44 ku,与预测编码蛋白分子量大小相符。序列分析结果表明,ORF44是He-arNPV的一个特有基因,ORF44融合蛋白的成功表达为深入研究HearNPV ORF44奠定了基础。

棉铃虫核型多角体病毒(HaSNPV)ORF99基因在昆虫细胞中的表达及亚细胞定位

棉铃虫核型多角体病毒ORF99基因Ha99是其基因组中特有的一个基因,序列分析发现Ha99基因开放阅读框包含354 bp核苷酸,编码118个氨基酸残基,预测相对分子质量为13 kDa.Ha99基因进一步在Bac-to-Bac系统中进行表达,SDS-PAGE和Western blot分析显示Ha99基因得到了成功表达,表达的相对分子质量为13kDa,与预测的大小相符.亚细胞定位分析表明,ORF99基因的表达产物主要定位在细胞质中.时序表达分析显示Ha99基因在病毒侵染后6 h开始表达,一直持续到侵染后122 h,表明Ha99基因是一个晚期表达的基因.

600亿PIB／g棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂防治烟青虫田间试验研究

600亿PIB／g棉铃虫核型多角体病毒（HeNPV）水分散粒剂是一种专业防治作物棉铃虫和烟青虫的生物药剂。试验结果表明，药后7d，600亿PIB／g棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂对烟青虫幼虫防治效果可达95％以上，药后10～15d，防效显著优于对照药剂甲维盐，持效期较之长3～8d。600亿PIB／g棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂对烟青虫具有较好的防治效果，且持效期较长，可在烟草生产上推广应用。

棉铃虫核型多角体病毒(NPV)防治制种玉米棉铃虫幼虫田间药效试验

在甘肃省临泽县沙河镇花园村进行了棉铃虫核型多角体病毒(NPV)防治制种玉米棉铃虫幼虫田间药效试验。结果表明:棉铃虫核型多角体病毒(NPV)以1 000~1 200 ml/hm^2喷雾防治制种玉米棉铃虫幼虫,防效在86%以上。

棉铃虫核型多角体和质型多角体在宿主昆虫继代后的毒力分析与比较

以３龄健康棉铃虫幼虫为供试昆虫，测定棉铃虫核型多角体和质型多角体在幼虫体内分别连续继代后的毒力变化。就质型多角体而言，不论是病毒的致死剂量（ＬＤ）还是致死时间（ＬＴ）均随着继代次数的增加而升高，继代１０次后的病毒致死活性平均丧失５９．３％，与未经继代的病毒相比．ＬＤ＿（５０）增加１０３倍，ＬＴ＿（５０）平均延长４．４３５ｄ；而核型多角体在继代过程中的毒力未见显著变化，提示核型多角体与质型多角体在宿主昆虫内连续继代的遗传学行为有可能不同。

棉铃虫核型多角体病毒泰国株ORF27全长基因序列分析及其截短型基因的原核表达

目的研究棉铃虫核型多角体病毒泰国株ORF27蛋白的功能,阐释其在传代效应中可能发挥的分子机制。方法用PCR方法从棉铃虫核型多角体病毒泰国株基因组中扩增ORF27基因;使用ProtParam、TMpred、SignalP、ScanProsite等生物信息学软件分析其理化特性、亚细胞定位、信号肽、跨膜结构、功能位点等;并将其氨基端截短型基因进行原核表达。结果ORF27基因序列全长768 nt,编码255 aa,分子质量约29.5 ku。生物信息学软件预测其具有多个功能基序。截短型重组载体表达出分子质量约35 ku的外源蛋白,主要以包涵体形式存在。结论棉铃虫核型多角体病毒ORF27蛋白可能具有非常广泛的生物学活性,调控多种细胞信号传导通路,调节细胞凋亡和细胞周期,参与传代效应的发生。

棉铃虫核型多角体病毒感染对宿主昆虫GST活性及其表达水平的影响

【目的】研究棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)感染宿主昆虫后对宿主谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性与基因表达水平的影响,明确病毒在侵染宿主过程中对宿主昆虫GST的调控作用。【方法】采用50和100PIB/只2种剂量的HearNPV病毒感染3龄棉铃虫,测定感染后不同时间试虫中肠GST活性与其编码基因的表达水平,对比分析病毒感染与未感染健康试虫的GST活性及其编码基因表达水平的差异。【结果】棉铃虫在HearNPV感染初期,GST活性显著提高,同时GST表达水平显著上调;随着感染时间的推移,GST活性与其编码基因的表达水平均显著下降,表明病毒感染后对宿主昆虫GST活性的影响与其对GST表达水平的调控相关。【结论】HearNPV感染棉铃虫过程中,病毒入侵能够激活宿主GST基因的表达,但病毒的持续感染最终会抑制GST编码基因的表达水平。

棉铃虫核型多角体病毒G4株Ha99蛋白的原核表达和orf99敲除回复子的构建

[目的]探索棉铃虫核型多角体病毒G4株Ha99蛋白的最佳表达条件。[方法]采用PCR从其基因组中扩增出orf99编码区,将其克隆到pGEM-Teasy载体,测序后将其亚克隆到原核表达载体pGEX-KG,转化大肠杆菌BL21加入IPTG诱导融合表达。并在orf99缺失杆粒HaBac△99的基础上构建了orf99敲除子HaBac-KO99及回复子HaBac-Rep99。[结果]SDS-PAGE分析表明,GST-Ha99融合蛋白得到成功表达,Westernblot进一步分析表明融合蛋白已得到成功表达。此外,PCR及酶切验证各载体构建成功。[结论]为orf99功能的进一步研究奠定基础。

棉铃虫核型多角体病毒朝鲜分离株BamHI-Ⅰ片段的核苷酸序列分析

对在朝鲜首次分离得到的棉铃虫核型多角体病毒朝鲜株 (HaSNPV KO)基因组BamHI Ⅰ片段的全序列进行了测序与分析 .该片段全长 1.895kb ,包括 p2 6基因 ,p10基因及 p74基因的 3′末端序列 .p2 6基因位于p10基因的上游 .排列方向与p10基因相同 ,该基因的编码区大小为 80 3bp ,编码 2 6 7个氨基酸 .p10基因的编码区大小为 2 6 1bp ,编码 87个氨基酸 .p74基因的排列方向与 p10和p2 6基因相反 .棉铃虫核型多角体病毒朝鲜株与棉铃虫核型多角体病毒中国株 (HaSNPV G4株 )的p2 6基因序列的同源性为 99.8% ,两个分离株的 p10基因序列完全相同 ,而 p74基因 3′末端序列的结果有 99.4 %的同源性 .朝鲜株与美洲株 (HzSNPV)的 p2 6和 p10基因序列的同源性分别为 98.8% ,98.7% ,而 p74基因 3′末端序列有 97.

棉铃虫核型多角体病毒Ha105的序列分析及敲除和回复菌株的构建

通过生物信息学方法对Ha105的生物功能进行预测,运用λ噬菌体Red重组系统介导的同源重组,在大肠杆菌BW25113中,用含有350 bp同源臂的氯霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因替换了棉铃虫病毒细菌人工染色体HaBacHZ8上的Ha105基因,然后利用Bac-to-Bac系统把Ha105回复到Ha105缺失的重组病毒上,构建了Ha105的缺失和回复重组病毒。生物信息学分析结果表明,Ha105是bro基因家族成员,含有Bro-N结构域,可能对宿主细胞的转录和病毒复制有一定影响。此外,重组病毒的PCR及酶切结果表明,成功构建了vHaHa105-KO-PH-gfp缺失菌株和vHaHa105-REP-PH-gfp、vHaHa105-REP-gfp回复菌株。该Ha105缺失及回复菌株的获得为进一步研究Ha105的功能奠定基础。

棉铃虫核型多角体病毒悬浮剂防治萝卜小菜蛾的药效试验

20亿PIB/ml棉铃虫核型多角体病毒SC是棉铃虫多角体病毒,能有效防治萝卜小菜蛾。试验结果表明,喷药后3d,能有效杀灭小菜蛾,对菊酯类、BT等农药抗性强的小菜蛾防治率高,是目前防治抗性小菜蛾的较佳选择药物之一。

600亿PIB/克棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂田间药效试验

棉铃虫核型多角体病毒是棉铃虫防治中应用较多的生物药剂，针对本地区棉花主要害虫棉铃虫，我们用该药不同剂量和同类药品的常规剂量进行田间防效比较试验和室内试验，观察试验效果。

棉铃虫核型多角体病毒防治棉铃虫药效试验

一、材料与方法 （一）供试药剂。600亿PIB／g棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂（河南济源白云实业有限公司提供）；30％乙酰甲胺磷乳油（杭州庆丰农化有限公司，市售）。