柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白Et RON2 L1-2特性与功能初步分析

为研究柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(RON2)同源分子——Et RON2 L1-2的分子特性与功能,利用实时荧光定量PCR、Western blot、入侵抑制试验、间接免疫荧光试验以及双分子荧光互补实验(BiFC)等方法分析其生物学特征。结果发现Et RON2 L1-2蛋白序列与Et RON2仅有29.69%的同源性,转录水平和蛋白水平均在第二代裂殖子阶段最高。抗r Et RON2 L1-2抗体对子孢子入侵细胞有明显抑制作用。Et RON2 L1-2蛋白主要分布于经PBS孵育子孢子的胞质和表面,并分布于经完全培养基孵育或入侵DF-1细胞后2 h子孢子的顶端;其表达量在滋养体和未成熟裂殖体增加,且在带虫空泡膜也有分布;在第二代裂殖子中主要分布于整个胞质。Et RON2 L1-2与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原4(AMA4)之间存在互作关系。

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白EtRON2_(L2)特性与功能初步分析

利用RT-PCR、间接免疫荧光实验、免疫印迹实验、抗体中和实验以及BiFC等方法对柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2同源分子—Et RON2_(L2)的特性和功能进行研究。结果发现Et RON2_(L2)氨基酸序列与常规的Et RON2仅有26.63%的同源性,mRNA水平在第二代裂殖子中最高,而蛋白水平在第二代裂殖子和子孢子阶段最高;Et RON2_(L2)在游离的第二代裂殖子和子孢子阶段主要分布于胞质,而在入侵后子孢子中主要分布于虫体表面;抗rEt RON2_(L2)多克隆血清处理组明显抑制子孢子入侵细胞;Et RON2_(L2)与EtAMA3之间存在互作关系。本研究为探究Et RON2_(L2)在球虫入侵过程中的作用机制奠定基础。

弓形虫棒状体颈部蛋白及棒状体蛋白研究的新进展

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫。因其复杂的生活史和致病机理,目前尚无有效的专用药物进行治疗。近年来,关于抗弓形虫免疫及疫苗的研究逐步深入,棒状体颈部蛋白(RONs)及棒状体蛋白(ROPs)作为重要的抗弓形虫疫苗的候选抗原分子,广泛应用于新型抗弓形虫疫苗的研究中。本文总结了近几年来弓形虫棒状体颈部蛋白及棒状体蛋白的研究新进展,尤其是这些RONs及ROPs作为新型DNA疫苗分子研究的最新进展。

刚地弓形虫棒状体蛋白17基因的克隆、表达及抗原性分析(英文)

目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株棒状体蛋白17(TgROP17)基因,并分析其抗原性。方法制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgROP17基因全长编码序列(GenBank登录号为AM075203.1)的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pGEX-6P-1载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将重组质粒pGEX-6P-1-TgROP17转化至E.coli Rosetta(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。分别以兔抗弓形虫血清和抗谷胱甘肽S转移酶(GST)标签抗体为一抗,采用蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白及其抗原性。结果 RT-PCR扩增产物约为1850 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示重组质粒pGEX-6P-1-TgROP17构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(M_r)约96 000的可溶性重组蛋白。Western blotting结果表明,诱导表达的蛋白质为带GST标签的重组蛋白,且能被兔抗弓形虫血清识别。结论获得刚地弓形虫重组ROP17蛋白,且具有抗原性。

刚地弓形虫棒状体蛋白17(ROP17)真核表达载体的构建、表达及其激酶活性分析

目的构建刚地弓形虫RH株棒状体蛋白17(ROP17)真核表达载体,对表达产物进行激酶活性的检测和功能分析。方法根据刚地弓形虫ROP17蛋白编码基因(GenBank登录号为AM075203.1)设计引物,以弓形虫RH株速殖子总RNA为模板,RT-PCR扩增目的基因片段,克隆至真核表达载体p3×Flag-CMV-14,构建重组质粒p3×Flag-CMV-14/TgROP17。经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法转染至人胚肾细胞(HEK293T),RT-PCR和蛋白质印迹(Western blotting)分析表达产物;Western blotting检测其激酶活性;流式细胞术分析ROP17对转染宿主细胞凋亡的影响。结果 RT-PCR结果显示,从RH株弓形虫速殖子中扩增出约1 850 bp的基因片段。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒p3×Flag-CMV-14/TgROP17构建成功且序列正确。RT-PCR和Western blotting结果显示,在转染p3×Flag-CMV-14/TgROP17的细胞中有TgROP17的表达,基因片段大小为1 850bp,蛋白质相对分子质量(Mr)约为70 000,而转染空质粒组未见表达。Western blotting结果显示,ROP17可以磷酸化c-Jun蛋白;流式细胞术结果显示,ROP17抑制喜树碱(CPT)诱导的细胞凋亡,6 h和12 h的抑制率分别为20.6%和24.1%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了真核表达载体p3×Flag-CMV-14/TgROP17,其表达产物具有激酶活性且能够抑制细胞凋亡。

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1融合基因的克隆与表达

目的进行弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)融合基因的克隆与表达,为弓形虫ROP2-P30基因工程复合抗原的制备做准备。方法半套式PCR扩增编码弓形虫P30的基因片段,克隆至已构建成功的重组质粒pUC119/ROP2中,经PCR和酶切鉴定正确的重组质粒pUC119/ROP2-P30再以SacⅠ/HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET28b上,鉴定正确的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌表达菌株BL21-Codon Plus(DE3)-RIL,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出700 bp P30基因片段,成功构建重组质粒pET28b/ROP2-P30,该质粒经PCR和酶切鉴定,与预期结果一致,并在大肠埃希菌中高效表达,产生相对分子质量(Mr)约为69 000的重组目的蛋白。结论弓形虫ROP2和P301融合基因克隆成功,并表达出预期的复合重组蛋白ROP2-P30。

弓形虫棒状体蛋白的研究进展

综述了弓形虫棒状体蛋白在弓形虫侵入宿主细胞和对宿主细胞毒力方面的研究进展,对部分棒状体蛋白作为疫苗候选分子的研究进行了概述,并对棒状体蛋白在疫苗研制方面的潜力进行了展望。表明,弓形虫棒状体蛋白对弓形虫侵入宿主细胞起重要作用,是研制弓形虫病疫苗的候选分子。

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白EtRON2基因的克隆及序列分析

预测并克隆柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(EtRON2)基因,分析其结构特点及与顶复门其他虫属间的差异。本研究利用生物信息学和比较基因组学技术注释拼接得到柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)棒状体颈部蛋白2(EtRON2)的基因序列,用RT-PCR方法扩增出Etron2全长ORF;以E.tenella子孢子的基因组DNA为模板,用PCR方法成功扩增出Etron2ORF片段的gDNA序列片段。生物信息学分析结果显示,Etron2ORF片段的gDNA含有11个内含子,ORF全长为4 020bp,编码一段全长为1 339个氨基酸的多肽片段,与其他物种RON2的氨基酸序列相似性为15%～41%;Etron2基因在顶复门原虫中相对保守,与犬新孢子虫及弓形虫相似性最高,亲缘关系最近,Etron2的成功克隆填补了柔嫩艾美耳球虫在此方面研究的空白,为进一步研究其功能打下了基础。

弓形虫棒状体蛋白18的原核表达及鉴定

目的:原核表达刚地弓形虫RH株棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs)18,建立检测和定位虫体ROP18蛋白的方法。方法:运用PCR技术扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因,克隆至pET-28a(+)载体,转化至大肠埃希菌Rosetta中诱导表达,经KCl染色切胶纯化重组ROP18蛋白,并制备其兔多克隆抗体。采用蛋白质印迹技术和间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测和定位ROP18在弓形虫速殖子体内的表达。结果:成功表达重组ROP18蛋白,并获得其多克隆抗体。经蛋白质印迹技术检测出虫体ROP18特异性条带,IFA技术检测出ROP18分布于虫体棒状体。结论:通过制备多克隆抗体,利用蛋白质印迹技术和IFA技术能检测和定位ROP18蛋白在弓形虫体内表达。

顶复门原虫棒状体蛋白ROP18的研究进展

顶复门原虫是一类专性的细胞内寄生原虫,包括刚地弓形虫、隐孢子虫、疟原虫、巴贝斯虫和球虫等,是人和动物的重要病原。这类原虫具有相似的亚细胞结构并能分泌与入侵相关的保守蛋白,尤其是在入侵宿主细胞阶段分泌的棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs)被认为是保护寄生虫入侵和繁殖的关键分子。其中ROP18是具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的ROP2家族蛋白成员之一,在刚地弓形虫入侵宿主细胞阶段发挥重要作用,是纳虫空泡(PV)形成时宿主细胞免疫的抑制因子。随着基因组学和蛋白质组学技术的不断发展,其相关研究也越来越深入。本文以目前研究最多的刚地弓形虫ROP18为主,对其发现历史、结构、分泌及定位、对宿主的毒力机制及应用现状做一综述。

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

为构建柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(Eimeria tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2)基因的重组质粒pCAGGS-EtRON2,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其核心编码区的一部分,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtRON2质粒,双酶切出目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核表达质粒pCAGGS-EtRON2。该重组质粒经酶切和测序鉴定后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtRON2基因的表达情况。所构建的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2经过双酶切鉴定,可见一条大小约为1172 bp的目的条带,测序结果与GenBank所登录序列完全一致;免疫印迹实验可见大小约为43 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到特异性红色荧光。研究结果表明已成功构建了EtRON2的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtRON2的生物学功能奠定了基础。

重组弓形虫棒状体蛋白5诱导小鼠的免疫应答及其抗弓形虫感染的保护作用

为探讨重组弓形虫棒状体蛋白5诱导的免疫应答及其免疫保护效应，本研究克隆表达了弓形虫棒状体蛋白5，并分析其诱导的细胞免疫、体液免疫应答和抗弓形虫感染的保护作用。采用PCR方法从刚地弓形虫cDNA中扩增出ROP5基因片段，将该基因片段克隆至pET-28a原核表达载体表达，用重组ROP5蛋白免疫BALB／c小鼠，ELISA检测免疫后小鼠抗体和细胞因子的变化。以强毒型RH株弓形虫攻击感染免疫小鼠，统计小鼠不同时间存活率，评价重组蛋白产生的免疫保护性。结果表明ROP5重组蛋白疫苗免疫BALB／c小鼠诱导机体产生高水平的IgG、IgG1、IgG2a抗体和IFN—y、IL-2及IL-10细胞因子。与PBS及佐剂对照组相比，重组蛋白免疫组小鼠的存活时间明显延长。本实验证实了ROP5重组蛋白免疫BALB／c小鼠能够诱导其产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答，以及一定的抗弓形虫感染保护作用。

弓形虫棒状体蛋白ROP2基因的克隆与表达

目的从弓形虫RH株总DNA中克隆棒状体蛋白ROP2基因片段,克隆至表达载体pET22b中,导入大肠杆菌中表达。方法采用半巢式PCR扩增法从基因组DNA中扩增编码ROP2基因片段,克隆至质粒pUC119中,经PCR和酶切鉴定后,进行DNA序列测定,并以SacⅠ/HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET22b上,重组质粒pET22b-ROP2转化大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL菌株中,经IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株总DNA中扩增到1.0kb的ROP2基因片段,构建成功重组质粒pUC119-ROP2,经DNA序列分析与已报道序列基本一致,重组质粒pET22b-ROP2在大肠杆菌中表达,产生一分子量约为45kDa的预期重组蛋白。结论克隆到的弓形虫棒状体蛋白ROP2在大肠杆菌中得到表达,构建成功的重组质粒pUC119-ROP2可用于下一步多基因融合的克隆操作。

弓形虫棒状体分泌毒性因子-假激酶的研究进展

弓形虫ROPs包括数十种速殖子分泌蛋白,在虫体的入侵、纳虫泡形成、增殖、出胞和逃避宿主细胞效应分子的攻击中发挥重要作用。ROPs属于蛋白激酶家族,其部分成员虽具有激酶结构域,但是由于某些关键位点的突变,失去了磷酸化宿主信号分子的作用,故称为假激酶。近年的研究认为,假激酶同样具有重要功能,例如通过变构调节激酶的活性;作为支架蛋白促进蛋白质分子间的相互作用。本文对弓形虫假激酶的结构特点和部分假激酶的功能进行了综述,对于研究弓形虫ROPs与宿主的相互作用、候选分子疫苗筛选和药物研发具有参考意义。

弓形虫棒状体蛋白16的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆刚地弓形虫RH株速殖子棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)16基因,并构建ROP16基因的原核表达系统,检测和定位ROP16蛋白的表达。方法:以弓形虫RH株速殖子基因组DNA为模板,PCR扩增弓形虫ROP16基因,克隆至p ET-32a(+)载体,在大肠埃希菌Rosetta中诱导表达。经KCl染色切胶法纯化重组ROP16蛋白,并制备其兔多克隆抗体。采用蛋白质印迹法和间接免疫荧光法检测和定位ROP16在弓形虫速殖子内的表达。结果:成功表达并纯化重组ROP16蛋白,制备了其多克隆抗体。蛋白质印迹法检测出相对分子质量为74 000的特异性条带,间接免疫荧光实验显示ROP16分布于弓形虫速殖子胞质内。结论:经原核表达重组ROP16制备的多克隆抗体能检测和定位ROP16在弓形虫速殖子内的表达。

刚地弓形虫棒状体蛋白2家族作为疫苗候选分子的研究进展

刚地弓形虫棒状体蛋白2家族(ROP2 family)是由弓形虫棒状体分泌的一类蛋白质,对弓形虫侵入宿主细胞及发挥细胞毒力起重要作用。ROP2家族成员包括ROP2、ROP4、ROP5、ROP8、ROP13、ROP16、ROP17和ROP18。近年来的研究发现,ROP2家族成员作为疫苗候选分子,可诱导宿主产生保护性免疫。本文综述了ROP2家族主要成员作为DNA疫苗或蛋白疫苗的研究进展。

刚地弓形虫棒状体蛋白18及其作为基因工程疫苗候选分子研究进展

刚地弓形虫棒状体蛋白18(rhoptry protein18,ROP18)是由棒状体分泌的、属于棒状体蛋白2家族的一员,具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,在虫体入侵和毒力的发挥方面起着重要作用。论文就ROP18蛋白的结构、毒力和作用机制及其作为基因疫苗候选分子的研究现状进行综述。

乙肝表面抗原和弓形虫棒状体分泌抗原多功能真核表达载体的构建与鉴定

目的探讨通过体外扩增乙肝表面抗原(HBsAg)基因,构建真核表达载体pcDNA3-HBsAg-ROP2的可行性。方法根据乙肝S基因序列及pcDNA3-p30-ROP2酶切位点等情况设计、合成引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增HBsAg基因片段;应用回收、纯化、酶切、连接等技术,将HBsAg基因替换pcD-NA3-p30-ROP2中的p30基因,并进行酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果 PCR扩增出约0.7 kb的目的基因HBsAg,成功构建pcDNA3-HBsAg-ROP2重组载体。PCR、酶切结果与理论相符,重组体包含了HBsAg和ROP2基因的完整序列。结论利用体外扩增乙肝表面抗原,可成功构建乙肝和弓形虫多功能重组载体pcDNA3-HBsAg-ROP2。

利用酵母双杂交筛选与弓形虫棒状体蛋白9相互作用的宿主蛋白

【目的】扩增弓形虫(Toxoplasma gondii)RH虫株速殖子的棒状体蛋白9(ROP9)基因,构建诱饵载体,转化Y2H Gold酵母感受态细胞,进行自激活活性检测,运用酵母双杂交系统筛选与ROP9存在相互作用的人脑组织蛋白质。【方法】运用RT-PCR扩增弓形虫RH虫株速殖子ROP9基因,构建诱饵载体pGBKT7-ROP9,转化Y2H Gold酵母感受态细胞,进行自激活活性检测,以转化诱饵载体pGBKT7-ROP9的Y2H Gold酵母菌株与人脑cDNA文库转化的Y187菌株双杂交筛选与ROP9相互作用的宿主蛋白,对阳性克隆进行测序,并用BLAST分析,筛选出与ROP9存在相互作用的人脑组织蛋白质。【结果】运用酵母双杂交系统,筛选出5个与ROP9相互作用的捕获蛋白质:内质网凝集素蛋白1(ERLEC1)、细胞色素c氧化酶铜分子伴侣(COX11)、驱动蛋白结合蛋白(KIAA1279)、GRCh38、膜联蛋白A11(ANXA11)。【结论】首次运用酵母双杂交技术筛选出与弓形虫ROP9相互作用的宿主蛋白质,为进一步研究ROP9与宿主细胞相互作用和机理奠定基础。