刚地弓形虫ROP10-ROP18真核表达载体的构建与鉴定

目的构建刚地弓形虫棒状体蛋白10(ROP10)、棒状体蛋白18(ROP18)复合基因真核表达载体pVAXDROP10-ROP18,并在HeLa细胞内表达目的蛋白。方法设计ROP10、ROP18基因特异引物,采用RT-PCR扩增ROP10、ROP18基因并测序,将ROP10和ROP18基因分别定向插入双启动子真核表达载体pVAXD的多克隆位点中,构建单价质粒pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18,然后将ROP18基因插入pVAXD-ROP10中构建双启动子真核表达载体pVAXD-ROP10-ROP18。经PCR和双酶切验证后将pVAXD-ROP10-ROP18转染至HeLa细胞内,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板分别进行ROP10基因和ROP18基因的RT-PCR鉴定;采用间接免疫荧光试验(IFA)检验ROP10和ROP18蛋白表达情况。结果成功克隆ROP10、ROP18基因片段并构建了重组质粒pVAXDROP10-ROP18,测序、双酶切和PCR验证重组质粒构建正确。分别将3种重组质粒转染至HeLa细胞后经RT-PCR鉴定,pVAXD-ROP10-ROP18组可同时扩增出1 761bp(ROP10基因)和1 665bp(ROP18基因)2个片段,而pVAXDROP10组和pVAXD-ROP18组分别扩增出1 761bp和1 665bp的目的片段;IFA显示pVAXD-ROP10组和pVAXDROP18组均有绿色荧光,即分别表达ROP10和ROP18蛋白。结论成功构建重组质粒pVAXD-ROP10-ROP18、pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18质粒可在真核细胞中分别表达ROP10和ROP18两种蛋白。