刚地弓形虫棒状体蛋白2家族作为疫苗候选分子的研究进展

刚地弓形虫棒状体蛋白2家族(ROP2 family)是由弓形虫棒状体分泌的一类蛋白质,对弓形虫侵入宿主细胞及发挥细胞毒力起重要作用。ROP2家族成员包括ROP2、ROP4、ROP5、ROP8、ROP13、ROP16、ROP17和ROP18。近年来的研究发现,ROP2家族成员作为疫苗候选分子,可诱导宿主产生保护性免疫。本文综述了ROP2家族主要成员作为DNA疫苗或蛋白疫苗的研究进展。

弓形虫棒状体蛋白2多克隆抗体制备纯化及其在免疫荧光定位中的运用

目的制备弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)多克隆抗体并纯化。方法将已构建的重组质粒pET32aROP2转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中,用0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白ROP2,分离上清和包涵体,包涵体洗涤后,用尿素溶解;取纯化蛋白与等体积福氏完全佐剂或不完全佐剂混合,背部皮下免疫新西兰大白兔3次,200μg/次,3次免疫之间分别间隔14 d和19 d,末次免疫10 d后收集兔血清,亲和纯化柱纯化,并用间接ELISA检测抗体效价,蛋白质印迹(Western blotting)分析抗体特异性。将弓形虫速殖子感染人包皮成纤维细胞(HFF细胞),利用制备所得的多克隆抗体采用免疫荧光法检测ROP2在感染细胞中的定位。结果通过诱导表达,获得重组蛋白ROP2,制备的兔源性ROP2抗体纯化后为单一蛋白抗体。间接ELISA结果显示,抗体滴度为1∶102 400;Western blotting结果显示,抗体特异性良好。同时,免疫荧光定位试验结果显示,ROP2定位在弓形虫的纳虫泡膜上。结论本研究制备并纯化了抗弓形虫ROP2的兔源性多克隆抗体,并成功应用于ROP2在弓形虫纳虫泡膜上的免疫荧光定位试验。

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白Et RON2 L1-2特性与功能初步分析

为研究柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(RON2)同源分子——Et RON2 L1-2的分子特性与功能,利用实时荧光定量PCR、Western blot、入侵抑制试验、间接免疫荧光试验以及双分子荧光互补实验(BiFC)等方法分析其生物学特征。结果发现Et RON2 L1-2蛋白序列与Et RON2仅有29.69%的同源性,转录水平和蛋白水平均在第二代裂殖子阶段最高。抗r Et RON2 L1-2抗体对子孢子入侵细胞有明显抑制作用。Et RON2 L1-2蛋白主要分布于经PBS孵育子孢子的胞质和表面,并分布于经完全培养基孵育或入侵DF-1细胞后2 h子孢子的顶端;其表达量在滋养体和未成熟裂殖体增加,且在带虫空泡膜也有分布;在第二代裂殖子中主要分布于整个胞质。Et RON2 L1-2与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原4(AMA4)之间存在互作关系。

弓形虫棒状体蛋白2重要家族成员核酸疫苗的研究进展

弓形虫呈世界性分布,可感染几乎所有的温血动物并引起弓形虫病,目前已成为危害人类健康和影响畜牧业生产的重要公共卫生问题,但迄今尚无理想的药物和防治手段。伴随着弓形虫重要毒性因子作用机制研究的日趋深入,研制安全有效的抗虫疫苗是防治弓形虫病的有效策略。棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs)是弓形虫在入侵宿主细胞过程中向宿主胞内分泌的效应蛋白因子,因在弓形虫入侵及逃避宿主免疫清除过程中发挥着重要的作用,目前已成为研制弓形虫疫苗的重要候选分子,其中棒状体蛋白2(ROP2)家族是研究最为深入的重要成员。本文就近年来ROP2家族重要成员的疫苗研究进展进行综述,旨在为研发安全有效的抗弓形虫病疫苗提供思路。

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白EtRON2基因的克隆及序列分析

预测并克隆柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(EtRON2)基因,分析其结构特点及与顶复门其他虫属间的差异。本研究利用生物信息学和比较基因组学技术注释拼接得到柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)棒状体颈部蛋白2(EtRON2)的基因序列,用RT-PCR方法扩增出Etron2全长ORF;以E.tenella子孢子的基因组DNA为模板,用PCR方法成功扩增出Etron2ORF片段的gDNA序列片段。生物信息学分析结果显示,Etron2ORF片段的gDNA含有11个内含子,ORF全长为4 020bp,编码一段全长为1 339个氨基酸的多肽片段,与其他物种RON2的氨基酸序列相似性为15%～41%;Etron2基因在顶复门原虫中相对保守,与犬新孢子虫及弓形虫相似性最高,亲缘关系最近,Etron2的成功克隆填补了柔嫩艾美耳球虫在此方面研究的空白,为进一步研究其功能打下了基础。

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

为构建柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(Eimeria tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2)基因的重组质粒pCAGGS-EtRON2,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其核心编码区的一部分,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtRON2质粒,双酶切出目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核表达质粒pCAGGS-EtRON2。该重组质粒经酶切和测序鉴定后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtRON2基因的表达情况。所构建的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2经过双酶切鉴定,可见一条大小约为1172 bp的目的条带,测序结果与GenBank所登录序列完全一致;免疫印迹实验可见大小约为43 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到特异性红色荧光。研究结果表明已成功构建了EtRON2的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtRON2的生物学功能奠定了基础。

弓形虫棒状体蛋白ROP2基因的克隆与表达

目的从弓形虫RH株总DNA中克隆棒状体蛋白ROP2基因片段,克隆至表达载体pET22b中,导入大肠杆菌中表达。方法采用半巢式PCR扩增法从基因组DNA中扩增编码ROP2基因片段,克隆至质粒pUC119中,经PCR和酶切鉴定后,进行DNA序列测定,并以SacⅠ/HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET22b上,重组质粒pET22b-ROP2转化大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL菌株中,经IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株总DNA中扩增到1.0kb的ROP2基因片段,构建成功重组质粒pUC119-ROP2,经DNA序列分析与已报道序列基本一致,重组质粒pET22b-ROP2在大肠杆菌中表达,产生一分子量约为45kDa的预期重组蛋白。结论克隆到的弓形虫棒状体蛋白ROP2在大肠杆菌中得到表达,构建成功的重组质粒pUC119-ROP2可用于下一步多基因融合的克隆操作。

弓形虫自然弱毒株棒状蛋白2基因克隆及序列分析

应用PCR法从弓形虫QHO株速殖子基因组DNA中扩增ROP2的基因片断,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经酶切及PCR鉴定后进行测序,并进行序列分析.结果表明,自然弱毒株的开放阅读框架(ORF)与ROP2基因已知序列(Z36906)的ORF具有97%的同源性,氨基酸序列具有95%的同源性.

利用BiFC技术研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1结构域Ⅰ与棒状体颈部蛋白2互作关系

为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E tAMA1-DⅠ片段和1395 bp的E tRON2片段,并与pGEM-T-easy载体连接构建相应重组质粒。获得的阳性重组质粒及双分子荧光互补技术的真核表达载体pBiFC-VN155和pBiFC-VC155用E c oRⅠ和B g I II进行双酶切,将E tAMA1-DⅠ、E tRON2分别与pBiFC-VN155、pBiFC-VC155连接,构建真核重组质粒pBiFC-VN155-E tAMA1-DⅠ和pBiFC-VC155-E tRON2。将2个真核重组质粒分别转染BHK细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定,可在BHK细胞中成功表达。将2个真核重组质粒共转染至BHK细胞中,同时将pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155、pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(delta)VC155共转染至细胞中分别作为阳性和阴性对照组。BiFC结果发现真核重组质粒共转染组和阳性对照组的BHK细胞均产生绿色荧光,而阴性对照组无荧光,表明E tAMA1-DⅠ与E tRON2蛋白之间存在互作关系。本研究结果为深入研究E tAMA1及E tRON2在球虫入侵过程中的功能与作用机制奠定基础。

西咪替丁伍用弓形虫ROP2蛋白免疫小鼠诱导免疫反应的初步研究

目的观察西咪替丁伍用弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)免疫小鼠诱导的免疫反应。方法 80只BALB/c小鼠随机分为A组、B组、C组和D组,各组分别经皮下注射PBS、弓形虫ROP2蛋白+PBS、弓形虫ROP2蛋白+福氏佐剂和弓形虫ROP2蛋白+西咪替丁[200 mg/(kg.d)]免疫BALB/c小鼠,每次ROP2蛋白免疫剂量为100μg/只(200μl),共免疫3次,每次间隔2周。于首次免疫前和每次免疫后2周,采血分离血清。末次免疫后2周,每组小鼠随机处死8只,无菌分离脾细胞,CCK-8法测定淋巴细胞增殖活性。流式细胞术检测小鼠全血T细胞亚群。ELISA法检测小鼠血清IgG抗体和γ干扰素(IFN-γ)水平。各组剩余12只小鼠经腹腔感染弓形虫RH株速殖子(5×104个/鼠),观察攻击感染后小鼠生存时间。结果末次免疫后2周,A、B、C和D组小鼠的血清IFN-γ水平分别为(659.750±239.962)、(872.750±197.011)、(1 600.750±480.680)和(1 494.375±451.655)pg/ml,血清特异性IgG抗体水平分别为0.504±0.078、0.592±0.160、1.068±0.111和1.046±0.147,脾细胞增殖活性分别为0.504±0.078、0.592±0.160、0.831±0.130和0.762±0.089,外周血CD4+/CD8+比值分别为0.504±0.078、0.592±0.160、0.831±0.130和0.762±0.089,C和D组均显著高于A和B组(前3个指标,均P<0.01;后者,均P<0.05),D组与C组的差异均无统计学意义(P>0.05)。各免疫组弓形虫攻击感染后,A、B、C和D组小鼠的生存时间中位数分别为96、108、132和132 h,C组和D组小鼠平均存活时间显著长于A组和B组(P<0.05),D组与C组的相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论西咪替丁可增强ROP2蛋白诱导的细胞免疫和体液免疫反应。

弓形虫ROP2-SAG1重组复合蛋白及其重组质粒的免疫效应

目的研究弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(SAG1)重组复合抗原(ROP2-SAG1)的核酸和蛋白两种疫苗的免疫效应。方法 60只雌性BALB/c小鼠随机均分为4组(每组15只),即rROP2-SAG1蛋白组、无菌生理盐水组、pcROP2-SAG1质粒组和pcDNA3.1质粒组,rROP2-SAG1组以2.5μgrROP2-SAG1重组蛋白与等体积佐剂乳化后,背部皮下多点免疫小鼠;无菌生理盐水组以等体积无菌生理盐水替代重组蛋白,首次免疫使用福氏完全佐剂,其余使用福氏不完全佐剂。pcROP2-SAG1组和pcDNA3.1组分别以pcROP2-SAG1和空质粒pcDNA3.1腿部肌肉注射免疫,剂量为100μg/次;以上各组小鼠共免疫3次,每次间隔2周。采用间接ELISA方法检测免疫后25、45和70d小鼠血清中特异性IgG抗体,及末次免疫后2周小鼠血清特异性IgG1和IgG2a抗体。用CCK-8细胞增殖法检测小鼠脾细胞增殖,间接ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清液中γ干扰素(IFN-γ)和白介素2(IL-2)表达水平。结果 rROP2-SAG1组小鼠血清特异性IgG抗体水平随着免疫时间的延长持续升高,pcROP2-SAG1质粒组抗体则随着免疫时间的延长相对稳定。末次免疫后2周,rROP2-SAG1组小鼠血清IgG1抗体水平(1.538±0.183)显著高于IgG2a(0.618±0.122)(P<0.05),而pcROP2-SAG1组IgG1抗体水平(1.107±0.137)与IgG2a(0.830±0.185)间的差异无统计学意义(P>0.05)。以特异性抗原rROP2-SAG1为刺激物时,rROP2-SAG1组小鼠脾细胞受特异性抗原刺激的增殖效果(A450值=0.348±0.042)显著高于pcROP2-SAG1组(0.123±0.018)(P<0.05)。rROP2-SAG1组小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ含量[(149.37±30.51)pg/ml]、IL-2含量[38.58±9.10)pg/ml],分别与pcROP2-SAG1组IFN-γ[(138.58l±29.92)pg/ml]、IL-2[37.47l±9.26)pg/ml]比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 ROP2-SAG1重组复合蛋白诱导的抗体水平、脾细胞增值效应显著高于重组质粒pcROP2-SAG1。

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株 pcDNA3.1 P30 ROP2 真核表达重组质粒,为进一步表达及 DNA疫苗的研制作准备。 方法 用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码 P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段,重组入 pUC18克隆载体,然后将 pUC18 P30 ROP2中的 P30 ROP2 外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。 结果 从弓形虫RH株基因组中扩增出特异的 P30、ROP2 片段,克隆成功 pUC18 P30 ROP2 重组质粒;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3. 1 P30 ROP2重组表达质粒。 结论 成功构建了弓形虫 pUC18 P30 ROP2重组克隆质粒,亚克隆成功 pcDNA3.1 P30 ROP2真核表达重组质粒,为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。

弓形虫ROP2基因的体外扩增及克隆

目的 构建弓形虫棒状体蛋白 2 (ROP2 )基因重组质粒。方法 根据ROP2基因已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段 ,插入pGEX 4T 1质粒 ,转化大肠杆菌TG1感受态细胞 ,经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约 10 43bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因 ,为下一步弓形虫诊断及疫苗研究打下了基础。

刚地弓形虫棒状体顶端表面蛋白2结构和功能的生物信息学分析

目的 应用生物信息学方法预测并分析刚地弓形虫顶端表面蛋白2(Toxoplasma gondii rhoptry apical surface protein 2,TgRASP2)的结构与功能,为刚地弓形虫的致病机制、药物靶点以及为疫苗的研发提供理论依据,方法 通过ToxoDB官网收集数据确定TgRASP2核酸序列和氨基酸序列;利用各类生物信息学在线网站分别对TgRASP2进行蛋白质基本理化性质、亲/疏水性、磷酸化位点、二级结构、三级结构以及抗原表位和抗原指数等进行预测和分析。结果 TgRASP2蛋白共含有437个氨基酸,分子式为C2185H3507N635O642S23,分子质量为49.682 13 ku,理论等电点为9.30,半衰期为30 h;蛋白不稳定系数为50.96,脂溶性指数为74.05,总平均亲水性系数为-0.620,属于亲水性蛋白;该蛋白无信号肽切割位点,无跨膜结构域,含有40个磷酸化位点;二级结构中α螺旋和延长链分别占34.10%和19.45%,β转角和无规则卷曲分别占7.55%和38.90%。经SMART网站分析,该蛋白的结构域含有4个低复杂区,无特殊结构域。该蛋白的抗原性为0.6651,共含有15个B细胞抗原表位,18个CTL抗原表位,15个Th抗原表位。结论 生物信息学预测TgRASP2蛋白具有亲水性,为可溶性蛋白。该蛋白存在多个潜在的B、T细胞抗原表位,具有免疫原性和反应原性,可作为弓形虫病疫苗候选蛋白。

弓形虫分泌蛋白ROP2的原核重组表达与免疫反应性鉴定

本研究在大肠杆菌工程菌中重组表达弓形虫棒状体蛋白2（ROP2），并初步评价其免疫反应性。主要步骤为体外细胞培养速殖子，提取总RNA，反转录获得cDNA，PCR扩增ROP2基因全长，与pET-41 Ek／LIC载体通过基因重组直接连接，在大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白GST-6×His—ROP2，最后以重组蛋白与人源弓形虫抗血清的Western blotting反应评价rROP2免疫反应性。本研究获得了ROP2全长重组蛋白，初步证明其良好的免疫反应性，为进一步改进弓形虫免疫学诊断方法，研究分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

弓形虫ROP2核酸疫苗免疫保护作用的研究

目的研究ROP2核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法42只BALB/c小鼠随机分为3组:实验组、空质粒组和PBS对照组,各组小鼠分别肌注pc-DNA3-ROP2重组质粒50μg、pc-DNA3空质粒50μg和PBS50μl,共免疫3次,每次间隔3周,末次接种量均加倍。末次免疫后2周,各组分别取4只小鼠的血清、脾和淋巴组织,检测CD4+、CD8+及各细胞因子。其余各组每鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子500个,观察其存活时间等。结果ROP2核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,小鼠血清抗体滴度高并能识别由基因重组体外诱导表达的ROP2蛋白抗原;实验组小鼠的CD4+T细胞增殖明显(69.5±3.4)%、CD4+/CD8+比值显著升高(4.69±1.32)%(P<0.01);其脾、淋巴结细胞培养液及血清中白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6、IL-12、γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)均有不同程度的升高,尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染180h后,实验组小鼠免疫保护率为88.9%,与对照组相比,小鼠存活时间明显延长、初始死亡时间明显推迟(P<0.01)。结论ROP2核酸疫苗具有较强的免疫原性,能产生良好的免疫保护作用。

弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗的研制

目的研究廉价有效的抗弓形虫核酸疫苗,以用于人类和畜类弓形虫病的防治。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取基因组DNA;根据ROP2基因序列,设计合成ROP2基因引物,应用PCR、酶切、连接、测序等技术,扩增ROP2基因片段,克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,制备抗弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗。应用该疫苗免疫小鼠,通过ELISA检测血清抗体,Western blot鉴定该疫苗的免疫原性;应用RH株弓形虫进行动物攻击实验,评价其安全性及免疫保护性。结果以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段,克隆于pc-DNA3质粒中,成功构建了pc-DNA3-ROP2重组质粒。测序结果显示,重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列,能完整表达ROP2的抗原蛋白。应用该疫苗免疫小鼠,能诱导产生强烈的细胞、体液免疫反应,使实验组小鼠攻虫感染后的存活时间明显延长,攻虫感染192 h后的存活率为77.8%,空质粒及PBS对照组存活率为0,差异有统计学意义(P<0.001);实验全程免疫小鼠未发生毒性及异常反应。结论该核酸疫苗具有很强的免疫原性,安全可靠,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用,具有很好的开发应用价值。

我国羊巴贝斯虫棒状体颈部蛋白RON2基因的克隆与结构和遗传进化分析

用牛巴贝斯虫棒状体颈部蛋白RON2基因序列BLAST我国羊感染的2种巴贝斯虫全基因组数据库,以获得的RON2基因保守序列片段为模板设计PCR引物;从6株羊巴贝斯虫基因组DNA和c DNA中扩增RON2基因全长序列,分析其基因结构特征;并通过序列比对和进化树构建,分析我国羊巴贝斯虫的遗传进化关系。结果显示,该基因无内含子,羊巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株(BspX J/DH)、莫氏巴贝斯虫天祝株/临潭株(BmTZ/LT)和莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株(BmNX/HB)RON2蛋白基因ORF的大小分别为4 029、4 047和4 044 bp,编码1 345、1 349和1 348个氨基酸。RON2蛋白的分子质量约为151 ku,等电点为8.91,具有3个跨膜区,N端第1～29位氨基酸为其信号肽区域。RON2核苷酸和氨基酸序列比对分析结果显示,BspXJ/DH与BmTZ/LT和BmNX/HB的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为67.0%～67.4%和69.2%～69.3%,BmTZ/LT和BmNX/HB间的相似性分别为92.8%～92.9%和91.1%～91.2%。系统发生树上羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫分别位于2大支,莫氏巴贝斯虫又被分为2小支。该结果为开展我国羊巴贝斯虫的分类关系和RON2基因功能的研究提供了基础数据。

弓形虫棒状体蛋白的免疫原性及其DNA疫苗的研制

目的研制抗弓形虫DNA疫苗,评价其免疫原性及免疫保护作用,进而推广应用。方法首先用RH株弓形虫速殖子提取基因组DNA,应用PCR、酶切、连接、测序等技术,扩增棒状体蛋白2(ROP2)基因片段,将其克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,制备抗弓形虫棒状体蛋白2DNA疫苗。再应用该疫苗免疫小鼠,取其血清、脾和淋巴结培养液检测免疫学指标评价其免疫原性,最后应用弓形虫攻击感染实验评价其免疫保护作用。结果PCR扩增出1.7kbROP2基因片段,克隆、构建出pc-DNA3-ROP2重组DNA疫苗能诱发小鼠产生强烈的细胞免疫和体液免疫反应,小鼠血清抗体滴度高且能正确识别由基因重组体外诱导表达的ROP2蛋白抗原;实验组小鼠CD4+T细胞增殖明显,体液中各细胞因子含量均有不同程度的升高,尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染180h后,疫苗免疫保护率为88.9%,小鼠存活时间明显延长。结论pc-DNA3-ROP2重组DNA疫苗具有较强的免疫原性,安全可靠,能产生良好的免疫保护作用。

弓形虫ROP2基因的克隆及原核表达

应用PCR技术从刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株的基因组DNA中扩增编码棒状体蛋白ROP2(rhpotry protein 2)的部分基因,构建pGEX-KG-ROP2重组表达质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转入E.coli BL21CodonPlus中,在IPTG诱导下表达,表达产物用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。结果表明,扩增的ROP2基因与GenBank上发表的相应基因序列的同源性达99.9%,该基因可以在大肠杆菌中高效表达,表达的ROP2融合蛋白表观相对分子质量约为64000,可被兔抗弓形虫免疫血清识别。