弓形虫不同发育时期棒状体颈部蛋白5基因的表达研究

为探究不同发育时期弓形虫棒状体颈部蛋白5(Toxoplasma gondii rhoptry neck protein 5,TgRON5)基因的表达情况与其毒力的相关性,本试验以Ⅱ型弓形虫PRU虫株作为研究对象,以弓形虫管家基因ACT1作为内参基因,分别对目的基因和内参基因设计特异性引物,通过对各基因建立标准曲线,确定二者扩增效率的一致性后,采用实时荧光定量PCR相对定量法对弓形虫4个不同发育时期(速殖子、缓殖子、未孢子化卵囊及孢子化卵囊)中TgRON5基因的表达情况进行检测与分析。结果显示,TgRON5基因在弓形虫各发育时期均有表达,其中,孢子化卵囊表达水平最高,未孢子化卵囊次之,速殖子较低,缓殖子最低,表明RON5蛋白的合成与分泌与虫体入侵宿主细胞的侵袭力有着密切的关系。本研究结果为阐明TgRON5蛋白参与弓形虫入侵的机理奠定了基础。

马泰勒虫棒状体颈部蛋白5基因的克隆与原核表达

从马泰勒虫新疆分离株PCR扩增棒状体颈部蛋白5(ron5)基因,构建pGEX-4T-ron5表达载体,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)进行原核表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,以谷胱甘肽S-转移酶标签兔单抗(1:2000)和马泰勒虫感染马阳性血清(1:100)作为一抗,以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和兔抗马IgG(1:5000)为二抗进行蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析。马泰勒虫新疆分离株的ron5基因长1434 bp,提交GenBank获得的登录号为OP777492。序列比对结果显示,马泰勒虫新疆分离株ron5的核苷酸和氨基酸序列与马泰勒虫WA株(GenBank登录号XM 004833657)的序列一致性最高,分别为99.6%和99.2%。系统进化树分析结果显示,马泰勒虫新疆分离株与马泰勒虫WA株聚在同一支上,二者亲缘关系最近。SDS-PAGE分析结果显示,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导3 h时,RON5的表达量最高;RON5的相对分子质量(Mr)约为79000,主要以包涵体形式表达。Western blotting分析结果显示,RON5可被谷胱甘肽S-转移酶标签抗体和马泰勒虫感染马血清识别,在Mr 79000处有明显条带。本研究克隆了ron5,表达的RON5具有较好的抗原性。