棘阿米巴角膜炎病原学诊断技术的研究进展

棘阿米巴角膜炎(AK)是一种由棘阿米巴原虫感染引起的严重危害视力的,疼痛性、顽固性、进行性角膜损伤性眼病。诱发因素主要有角膜接触棘阿米巴原虫污染水源、眼部外伤、角膜接触镜佩戴不当等。AK如未早期诊断和及时治疗,可导致永久性视力丧失。AK主要根据病史、临床症状和病原学检查进行诊断,其中病原学检查是确诊AK的“金标准”。病原学检测方法包括角膜组织刮片的镜检法、培养法、分子生物学技术、免疫学检测及体内共聚焦显微镜技术等。本文就近年来国内外AK病原学诊断技术的研究进行综述。

棘阿米巴感染治疗药物的研究进展

棘阿米巴(Acanthamoeba)是一类分布广泛、侵入人体后可引起严重、甚至致命感染的机会致病性寄生原虫。药物治疗仍是目前棘阿米巴感染首选的治疗方法。但滋养体抗药性的产生及药物治疗过程中滋养体可转变为休眠形式的抗药性包囊,导致感染复发,使治疗十分困难。近年来,传统药物不断改进,新型药物持续研发,为棘阿米巴感染的精准、高效治疗提供了广阔前景。该文概述抗棘阿米巴药物如抗细菌类药物、抗真菌药物、双胍类和新型制剂(如纳米粒子和树枝状大分子)等的研究现状,以期为棘阿米巴感染的有效治疗提供参考,为新型药物的研发提供思路。

卡氏棘阿米巴肌动蛋白1的免疫学特性和细胞黏附功能

目的:探讨卡氏棘阿米巴(Ac)肌动蛋白1 (Actin 1)(Ac-Actin 1)的免疫学特性,初步阐明Ac-Actin 1介导Ac虫体黏附宿主细胞并参与Ac虫体入侵的作用。方法:以Ac滋养体cDNA为模板,构建原核表达载体pET 22b (+)-Ac-Actin 1,转化大肠埃希菌感受态细胞BL21 (DE3);1 mmol·L^(-1)异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)体外诱导表达重组Ac-Actin 1蛋白(rAc-Actin 1),十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对rAc-Actin 1进行可溶性分析,通过亲和层析方法纯化带有His标签的rAc-Actin 1。3只新西兰白兔随机分为对照组(1只)和实验组(2只);实验组兔以rAc-Actin 1为免疫原皮下注射400μg,对照组兔注入等量生理盐水,制备抗rAc-Actin 1多克隆兔血清;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测2组兔抗rAc-Actin 1多克隆抗体效价并测定IgG亚型,Western blotting法检测抗rAc-Actin 1多克隆兔血清与rAc-Actin 1的免疫反应性,间接免疫荧光实验(IFA)检测Ac-Actin 1在Ac滋养体中的定位。以正常滋养体为对照,抗rAc-Actin 1多克隆兔血清阻断Ac滋养体后与Vero细胞共孵育,显微镜观察Ac-Actin 1对Vero细胞的黏附作用。结果:SDSPAGE和BCA蛋白浓度检测,获得高浓度rAc-Actin 1 (1.7 g·L^(-1))蛋白。ELISA法检测,制备的兔抗rAc-Actin1特异性多克隆抗体效价为1∶6 400, IgG1和IgG2a浓度分别为116.76 g·L^(-1)和1 136.15 mg·L^(-1)。Western blotting法检测,兔抗rAc-Actin 1多克隆抗体可与rAc-Actin 1发生特异性结合,具有良好的免疫反应性。IFA检测,rAc-Actin 1主要定位于Ac滋养体的细胞膜上。显微镜观察,与对照组比较,随着抗体与虫体孵育时间的延长,实验组Ac滋养体对Vero细胞的黏附率明显降低(P<0.01),抗rAc-Actin 1特异性多克隆抗体可有效阻断Ac滋养体与Vero细胞的黏附。结论:rAc-Actin 1具有良好的免疫原性和免疫反应性,参与Ac虫体与宿主细胞的黏附作用。

棘阿米巴角膜炎诊断与治疗专家共识(2023)

棘阿米巴角膜炎(AK)是一种严重的致盲角膜病,起病隐匿,临床表现主要为眼表刺激症状、角膜浸润和溃疡,如未得到及时合理诊疗可引起患者视力损害。AK早期体征不典型,临床医生和患者目前对该病的认知尚不足,易误诊或漏诊,造成患眼视力不可逆损害,影响患者视觉质量和生活质量。目前国内外对AK的诊断和治疗尚缺少统一、规范的方案,导致治疗效果不明确,治疗方法不统一。中国医师协会眼科医师分会眼感染学组组织国内眼感染和角膜病专家对我国AK诊疗中存在的问题进行广泛调查和归纳,并在大量检索和复习国内外相关文献的基础上,采用德尔菲法联合面对面讨论的方法,结合我国相关专家的临床实践和经验,就AK的流行病学、发病危险因素、病原学及其发病机制、诊断和鉴别诊断、治疗方案及其流程等问题进行认真讨论,形成本专家共识意见,以指导和规范AK的诊治工作。

棘阿米巴角膜炎的实验诊断

[目的 ]寻找棘阿米巴角膜炎快速诊断和棘阿米巴快速鉴定的方法。 [方法 ]10 %氢氧化钾 (KOH)湿封片镜检、棘阿米巴培养、倒置显微镜观察、病理切片H .E .染色和SPA染色检查。 [结果 ]角膜刮片及手术切除的角膜材料 ,经 10 %氢氧化钾湿封片镜检 ,前者检出 7例棘阿米巴角膜炎病例 ,后者确诊 5例 ;手术切除的角膜材料经培养 ,分离出 6株棘阿米巴 ;应用倒置显微镜直接观察 ,检出棘阿米巴的包囊、滋养体和棘刺。 [结论 ]应用 10 %KOH湿封片镜检可对棘阿米巴角膜炎作出快速诊断 ;通过倒置显微镜直接观察也可对棘阿米巴角膜炎在 2 0h内作出诊断 ;倒置显微镜可直接观察和鉴定棘阿米巴 ,方法简便、无污染、快速及实用。

棘阿米巴表达文库的免疫学筛选

通过棘阿米巴感染兔血清对棘阿米巴原虫全长cDNA文库进行免疫学筛选,采用角膜注射的方法构建棘阿米巴感染兔模型,收集感染后第1、7、14、21、28、35、42天兔血清,ELISA法测定抗体滴度;选用感染后第7、14、21天和28天混合血清对c DNA文库进行免疫学初筛和复筛;阳性克隆送样测序,并进行PCR鉴定和序列分析。结果:角膜刮片镜检,感染动物试验组均检出棘阿米巴的包囊和滋养体,感染血清抗体滴度在感染后第7天升高显著,在感染后第28天达到高峰;经免疫学筛选共获得3个阳性克隆,经测序和PCR鉴定,3个克隆的插入序列和ORF长度分别为:actin1,774 bp、polyubiquitin,234 bp和HSP20,564 bp。本研究为进一步棘阿米巴原虫感染的快速诊断试剂和免疫预防分子的筛选奠定基础。

棘阿米巴角膜炎的实验室诊断及实验研究

目的 :找出快速诊断和鉴定棘阿米巴角膜炎的方法 ,建立棘阿米巴角膜炎的动物模型。方法 :10 %氢氧化钾 (KOH)湿封片镜检、棘阿米巴原虫培养、倒置显微镜观察、病理切片作HE染色和PAS染色检查。通过家兔应用激素 3天后 ,经角膜基质内注射棘阿米巴原虫悬液。结果 :角膜刮片及手术切除的角膜材料 ,经 10 %氢氧化钾 (KOH)湿封片镜检 ,前者查到 8例棘阿米巴角膜炎病例 ,后者确诊 5例 ;手术切除的角膜材料经原虫培养 ,分离出 6株棘阿米巴原虫 ;应用倒置显微镜直接观察 ,见到棘阿米巴原虫的包囊、滋养体和棘刺。建立了家兔棘阿米巴角膜炎动物模型。结论 :应用 10 %KOH湿封片镜检以及通过倒置显微镜直接观察培养的原虫可对棘阿米巴角膜炎作快速诊断 ;倒置显微镜可直接观察和鉴定棘阿米巴原虫 ,方法简便、不污染、快速 ;

聚合酶链反应技术对棘阿米巴角膜炎诊断的临床应用

目的 探讨聚合酶链反应 (PCR)技术临床应用于棘阿米巴角膜炎诊断的可行性及优越性。方法 以一段特异性通用引物并配合热启动聚合酶链反应技术来检测临床标本中的棘阿米巴原虫。结果 在门诊初诊为棘阿米巴角膜炎的 13例 (13只眼 )中 ,通过 PCR检测法有 11只眼证实为棘阿米巴原虫感染 ,同时角膜刮片染色后镜检有 5例发现了棘阿米巴包囊。

棘阿米巴的分型及鉴定研究进展

棘阿米巴角膜炎是一种严重威胁视力的感染性眼病 ,近年发现已报道的病例数逐年增加。棘阿米巴角膜炎的预后除与早期诊断、治疗及宿主免疫反应有关外 ,还与感染虫株的不同有关。在临床与研究工作中 ,已经可以准确鉴定棘阿米巴属 ,但在属以下水平鉴定棘阿米巴则较困难。

棘阿米巴角膜炎模型和实验室诊断研究进展

棘阿米巴原虫是一种机会致病自由生原生生物,主要引起人类两种疾病,即棘阿米巴脑炎和棘阿米巴角膜炎。本文综述了阿米巴角膜炎实验室诊断的研究进展。

棘阿米巴滋养体对HeLa细胞的细胞毒性作用

目的 探讨处于不同分类地位的 5株棘阿米巴滋养体对人HeLa细胞的细胞毒性作用。方法 将 5株不同虫株的棘阿米巴滋养体分别与体外培养的人HeLa细胞混合 ,观察其对肿瘤细胞的影响。并采用光镜确定肿瘤细胞的形态学变化特征 ,采用MTT(四甲基偶氮唑盐 )法检测并比较这 5种棘阿米巴对肿瘤细胞作用的差异。结果 MTT法显示 ,当棘阿米巴滋养体与HeLa细胞以 1∶1比例混合时 ,对肿瘤细胞表现出较强的细胞毒性作用。该作用不仅具时间依赖性 ,且因棘阿米巴的虫株不同而异。光镜下染色标本显示 ,经 5株棘阿米巴滋养体作用后的肿瘤细胞均出现了核染色质边集浓缩和胞膜出空泡等细胞凋亡的形态学特征。结论 这 5株棘阿米巴滋养体对HeLa细胞均有不同程度的细胞毒性作用 ,并诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡。

棘阿米巴角膜炎的诊断和治疗探讨

目的 探讨棘阿米巴角膜炎的临床与实验室诊断方法 ,寻找有效滴眼液用以治疗。方法 观察分析 2 5例棘阿米巴角膜炎感染各阶段的临床表现 ,通过角膜细胞学检查、阿米巴分离培养、角膜活检及组织病理学检查确诊 ,检测药物对棘阿米巴的抗原虫作用及临床疗效。结果 感染自角膜上皮层开始 ,进行性侵入基质致盲。细胞学检查见包囊和 /或滋养体 (88 9% )。棘阿米巴培养阳性率 5 7 9%。洗必泰、甲硝唑滴眼液治疗棘阿米巴角膜炎有良效。抗原虫治疗2 4例 (2 5眼 ) ,治愈 2 1眼 ,无复发。结论 棘阿米巴角膜炎并非罕见 ,常因被误诊、误治导致视力丧失。重要的是早期诊断与抗原虫治疗。

棘阿米巴对黑色素瘤细胞毒性作用初探

目的 :探讨棘阿米巴滋养体分泌物中对小鼠黑色素瘤细胞B16起细胞毒作用的物质。方法 :采用MTT (四甲基偶氮唑盐 )法检测棘阿米巴滋养体分泌物对B16的细胞毒作用。结果 :MTT法表明棘阿米巴分泌物对靶细胞有一定的细胞毒作用 ,丝氨酸酶抑制剂可抑制大部分的细胞毒作用。 6 0 %硫酸铵可沉淀大部分起细胞毒作用的成分 ,主要为丝氨酸酶类。结论 :棘阿米巴滋养体分泌物在棘阿米巴致靶细胞损伤中起重要的作用 。

18S rDNA的PCR扩增技术在棘阿米巴角膜炎临床诊断中的应用

目的:探讨利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增棘阿米巴18S rDNA在角膜炎早期临床诊断应用中的可行性。方法:以18S rDNA为模板,利用特异性引物JDP1-JDP2配合PCR技术来检测临床标本中的棘阿米巴原虫。结果:在临床拟诊为棘阿米巴角膜炎的16例(16眼)中,通过PCR检测法有12眼证实为棘阿米巴原虫感染,同时100g/L KOH角膜刮片后镜检有5例发现了棘阿米巴包囊。两种诊断方法用Fisher确切概率法统计,P<0.05。结论:18S rDNA PCR技术对正确诊断早期棘阿米巴角膜炎有重要的临床应用价值。

棘阿米巴角膜炎的实验室检查和原虫的鉴定

目的应用简便的方法对棘阿米巴角膜炎进行诊断，并对棘阿米巴原虫进行鉴定。方法角膜刮片或培养的原虫材料经１０％氢氧化钾液湿封片镜检；角膜材料经原虫培养；应用倒置显微镜对棘阿米巴属进行观察和鉴定；角膜病理切片经ＨＥ和ＰＡＳ染色。结果１０％ＫＯＨ湿封片镜检，５例角膜刮片中有２例及培养阳性的原虫材料均呈现棘阿米巴原虫的包囊。同一病例，４例中有３例培养出棘阿米巴原虫。在倒置显微镜下可见棘阿米巴原虫的包囊和滋养体以及滋养体上的棘状伪足。病理切片经ＨＥ和ＰＡＳ染色均显示原虫的包囊。结论１０％ＫＯＨ湿封片可对棘阿米巴角膜炎作初步诊断，最后诊断需经原虫培养获得，应用倒置显微镜可对棘阿米巴原虫进行观察和鉴定。角膜病理切片上看到原虫可进一步印证原虫培养的结果。

家兔棘阿米巴角膜炎动物模型的建立

目的:建立棘阿米巴角膜炎的动物模型。方法:在6 只新西兰家兔角膜基质层内注射地塞米松3 d 后,再注入棘阿米巴原虫悬液。结果:6 只家兔均发生角膜炎。经家兔角膜刮片用10% 氢氧化钾封片镜检、角膜组织原虫培养和病理切片染色检查证实,成功地建立了家兔棘阿米巴角膜炎动物模型。结论:通过角膜基质内注射建立的家兔棘阿米巴角膜炎动物模型。

非接触镜使用者的棘阿米巴角膜炎一例

将一例环形角膜溃疡的手术切除角膜材料,用2%无营养无盐琼脂培养基加大肠杆菌肉汤进行培养,成功地分离出了棘阿米巴原虫,原虫在该培养基上生长良好,并可传代生长。培养物经10%氢氧化钾湿封片,显微镜下观察,可见棘阿米巴原虫的双层壁包囊。患者的典型表现为角膜环形基质浸润,伴剧烈眼痛。经角膜板层切除加结膜瓣掩盖手术及术后药物治疗,痊愈出院。

大蒜素体外对卡氏棘阿米巴超微结构的影响

用不同浓度大蒜素处理处于对数生长期的卡氏棘阿米巴(Acanthamoeba castellanii,T4型),24h后在透射电镜下观察其超微结构损伤情况。结果表明,大蒜素浓度为50μg/ml时,卡氏棘阿米巴的超微结构轻度破坏,浓度为500μg/ml时,其结构严重破坏,虫体坏死。大蒜素对体外培养的卡氏棘阿米巴(T4型)超微结构有破坏作用。

角膜表面镜片术建立兔棘阿米巴角膜炎模型

目的建立一种理想的模拟临床人角膜棘阿米巴感染的动物模型,并对其角膜组织损伤的临床表现和组织病理学改变进行观察。方法20只新西兰大白兔利用角膜表面镜片术建立棘阿米巴角膜炎的动物模型,在角膜植片内皮面作"#"形划痕,用10-0尼龙缝线将其固定于受体角膜上,将棘阿米巴滋养体混悬液注入植片与植床间,建立棘阿米巴角膜炎模型,右眼为实验眼,左眼为对照眼;并在接种后第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第14天、第28天行裂隙灯显微镜检查及临床评分、角膜刮片湿封片镜检、角膜组织病理检查及培养。结果应用角膜表面镜片术成功建立兔眼棘阿米巴性角膜炎的动物模型,并经角膜刮片及培养、组织病理切片染色检查证实。实验眼角膜出现水肿,基质环形浸润,角膜新生血管等表现,对照眼均未见感染;实验眼病理组织切片上可见基质层内的棘阿米巴滋养体或包囊,伴有中性粒细胞、单核巨噬细胞、嗜酸性粒细胞等浸润。结论应用角膜表面镜片术建立的兔棘阿米巴角膜炎动物模型模拟了临床人角膜棘阿米巴感染过程,为研究棘阿米巴角膜炎的发病机制及临床治疗奠定了可靠的实验基础。

棘阿米巴土壤分离株CB/S1的18S rDNA基因型鉴定

目的鉴定从北京市区土壤中分离的棘阿米巴分离株Acanthamoebasp.CB/S1的18S rDNA基因型。方法从土壤分离的CB/S1株中提取基因组18S rDNA,应用棘阿米巴属特异性引物PCR扩增18S rDNA序列。将扩增产物测序后用分子生物学软件Clustal X进行序列分析,与基因库中已有T1至T12型序列进行比较并构建进化树。结果与结论从北京市区土壤中分离的的棘阿米巴分离株CB/S1的18S rDNA全基因序列分别为2291bp,其基因型属于T5型。