Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗与常规DNA疫苗的比较

比较Semliki森林病毒(SFV)衍生的复制型DNA疫苗载体(复制型载体)和常规非复制型DNA疫苗载体(非复制型载体)的导入效率、表达效率、诱导凋亡率和免疫效果,从而评价其作为DNA疫苗载体的应用前景。使用等量SFV载体和常规DNA载体同等效率转染细胞后,复制型载体表达强度比非复制型载体高约3倍,其诱导凋亡的能力是非复制型载体的11倍;以不同剂量的SFV载体和常规DNA载体分别转染BHK21细胞,复制型载体各剂量组载体的表达量均高于非复制型载体。复制型载体在1μg组出现峰值,而非复制型载体则出现在4μg组。体内免疫的结果表明,SFV载体pSCA-SS1免疫的各组小鼠中,低剂量1μg组小鼠的总抗体滴度高于10μg和100μg剂量组;1μgpSCA-SS1免疫的小鼠产生的总抗体滴度与CTL水平,分别与pcDNA3-SS1免疫的小鼠中10μg和100μg组相当。但10μg、100μg组pSCA-SS1免疫小鼠的总抗体及CTL水平,都低于pcDNA3-SS1免疫的小鼠的10μg、100μg组。结果提示:SFV衍生的复制型DNA疫苗载体,在低剂量组时即可诱生与常规DNA疫苗载体高剂量组相近的免疫效果。

基于DNA的Semliki森林病毒复制子载体体内外高水平表达外源基因

基于DNA的复制子载体显著地提高了复制子载体的应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因,大规模制备重组病毒颗粒,在体内可用于复制子疫苗和基因治疗载体研究.将复制子RNA的cDNA置于RNA聚合酶Ⅱ启动子和转录终止子控制下时,基于RNA的复制子载体可转变为基于DNA的复制子载体.当DNA载体转染细胞后,第一阶段,RNA聚合酶Ⅱ启动子在核内起始合成RNA,经过加工和修饰后运输到细胞质中,相当于复制子RNA,第二阶段,该RNA自我复制及表达外源基因,相当于病毒RNA复制循环.在成功地构建了基于DNA和RNA的双功能复制子表达载体pSCTA和辅助载体pSHCTA的基础上,为了获得高效的基于DNA的复制子载体,对其进行改进而构建了共4种不同的基于DNA的semliki森林病毒复制子,通过对表达载体和相应的辅助载体表达报告基因及对制备重组病毒颗粒的能力进行比较,获得了复制能力提高的复制子载体pSCAR和pSHCAR.该表达载体pSCAR可高水平表达外源基因,与辅助载体pSHCAR共转染可制备高滴度的重组病毒颗粒,并且也能表达抗原基因.另外,报告基因在DNA复制子载体注射的小鼠体内得到了高水平表达,并且DNA免疫小鼠后也诱导产生高滴度特异性抗体以及细胞免疫反应.结果表明,经过改造SFV复制子载体,获得了高效的基于DNA的SFV复制子载体.该复制子载体增强了原复制子载体应用能力,并有潜力作为复制子疫苗和基因治疗载体.

基于DNA和RNA的双功能Semliki森林病毒复制子载体的构建

以semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1和辅助载体pSFVhelper2为骨架,用CMVIE和T7启动子替换SP6启动子并在3′UTR下游插入BGH转录终止子,构建了基于DNA和RNA的复制子表达载体pSMCTA和辅助载体pSHCTA。在DNA和RNA二种递送方式上证实该表达载体可高水平表达外源基因,与辅助载体共转染可制备具有感染能力并能表达外源基因的重组病毒颗粒。构建的基于DNA和RNA的双功能复制子载体显著地提高SFV载体应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因及大规模制备重组病毒颗粒,在体内也可用于研制复制子疫苗和基因治疗载体。

一种基于塞姆利基森林病毒复制子的新型复制子载体

RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建了一种完全基于DNA的复制型表达载体pSFV1CS ,将增强型绿色荧光蛋白基因EGFP插入其中 ,构建了重组质粒pSFV1CS EGFP ,通过转染 2 93T细胞 ,证实外源基因能在其中高效表达。

基于西门利克森林病毒复制子的“自杀性”DNA疫苗载体的构建及其体外表达特性

对西门利克森林病毒(SFV)复制子质粒型表达载体pSFV1进行改造,即在SFV非结构蛋白(nSPs) 上游插入依赖于RNA聚合酶Ⅱ的人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子序列(hCMV IE Pro/Enh),同时在pS- FV1的多克隆位点下游插入SV40 poly(A)终止信号序列,获得可以完全在DNA水平上操作并具有自主复制功能的表达载体pSFV-DNA。为了进一步探讨改造载体的转染效率、表达能力以及是否能诱导细胞凋亡等特性, 将报告基因EGFP插入pSFV-DNA中亚基因组启动子下游,构建的重组表达质粒pSFV-EGFP转染BHK-21 细胞,转染后12 h即可观察到荧光,但转染效率明显低于直接由hCMV IE Pro/Enh驱动的EGFP真核表达质粒pEGFP-C1;提取转染后48 h的细胞基因组DNA,电泳发现pSFV-EGFP转染细胞均呈典型的DNA断裂(ladder),而pEGFP-C1转染细胞未观察到这种现象。上述结果表明:改造的载体不仅可完全在DNA水平上操作,而且能正确表达外源基因和诱导细胞凋亡,为开展各种病原微生物的“自杀性”DNA疫苗研究提供了良好的工具。

猪2型圆环病毒ORF2基因在塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的新型真核表达载体中的表达

猪 2型圆环病毒 (porcinecircovirus 2 ,PCV2 )是断乳仔猪多系统衰竭综合征 (postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)的原发性病原。PCV2的ORF2编码病毒唯一的结构蛋白Cap。根据GenBank中公布的PCV2JXL株的序列设计一对引物 ,应用PCR方法从该毒株感染的PK 15细胞中扩增出完整的ORF2基因 ,将此基因克隆于本实验室此前构建的塞姆利基森林病毒 (SemlikiForestvirus,SFV)RNA复制子衍生的新型真核表达载体pSFV1CS中的BamHⅠ位点 ,获得重组质粒pSFV1CS Cap。用pSFV1CS Cap分别转染BHK 2 1细胞和 2 93T细胞 ,经间接免疫荧光试验检测表明 ,PCV2ORF2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验表明 。

传统DNA疫苗载体与Semliki森林病毒复制子对HIV-1 Pr55^(gag)表达与体液免疫原性的比较性研究

为探索Semliki森林病毒 (SFV)衍生的复制型DNA载体可否用于HIV疫苗的候选载体 ,对该载体与传统DNA疫苗载体对HIV - 1Pr5 5 gag的表达与体液免疫原性进行了系统比较研究。将野生型 (wtgag)及密码子改造(syngag)的HIV - 1ⅢBgag 基因分别克隆于SFVDNA载体及传统DNA疫苗载体 [pCDNA3 1(+) ],对其Pr5 5 gag细胞内表达水平、Pr5 5 gag病毒样颗粒释放、以及在BALB/c鼠的体液免疫原性进行了比较。在 2 93T、H12 99、C2C12和BHK细胞系中 ,SFV -wtgag可以Rev非依赖方式有效表达Pr5 5 gag ,而 pC -wtgag转染的细胞不能有效表达Pr5 5 gag,从而不能诱导小鼠产生免疫反应。虽然SFV质粒的细胞转化效率明显低于pCDNA载体 ,SFV -wtgag和SFV -syngag在细胞内Pr5 5 gag的表达量与 pC -syngag相似 ,而Pr5 5 gag病毒样颗粒的释放明显低于 pC -syngag。在肌内注射免疫的小鼠中 ,低剂量 (0 1和 1 0 μg)的SFV及 pCDNAgag表达质粒均未诱导出GAG特异性免疫反应。在高剂量 (10 ,30 ,10 0 μg)免疫组中 ,与SFVgag表达质粒相比 ,pC -syngag可诱导出较高水平的TH1型GAG特异性抗体。SFV -syngag较SFV -wtgag可诱导出高水平的体液免疫反应。结果提示 ,SFV衍生的复制子单独使用不能在小鼠诱导出优于传统DNA疫苗载体的HIV - 1GAG特异性?

重组Semliki森林病毒疫苗的研制现状

Semliki森林病毒引起的Semliki脑炎是一种自然疫原性疾病。该病毒可诱导感染的宿主产生细胞、体液和黏膜免疫应答,可通过分子生物学技术改造为理想的疫苗载体,从而表达病毒和细菌的多种蛋白。这些病原体包括流行性感冒病毒、马流感病毒、Ⅰ型人类免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、猪瘟病毒、罗氏病病毒、乙型肝炎病毒、猪园环病毒Ⅱ型、布鲁氏菌、肉毒梭菌等,本文对Semliki森林病毒介导的病原体疫苗的研制现状加以阐述。

昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法的建立

[目的]建立昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法。[方法]利用Beacon Designer7.0软件设计引物,以人工合成昆津病毒巴马哈森林病毒E基因的片段作为模板,验证该方法的灵敏度及特异性。[结果]最低检出限:昆津病毒1.83×106 copies/μL,巴马哈森林病毒2.02×106copies/μL。[结论]建立的昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好等特点,适合于昆津病毒和巴马哈森林病毒的快速检测。

贵州省巴马森林病毒和罗斯河病毒感染的调查研究

目的了解贵州省虫媒病毒中巴马森林病毒(BFV)、罗斯河病毒(RRV)的感染现状,为不明原因病毒性脑炎防治工作提供科学依据。方法 2005-2008年在贵州省采集不明原因发热和病毒性脑炎病例检测BFV、RRV IgM抗体,并对2007年健康人群进行BFV、RRV IgG抗体检测。结果①共检测204例不明原因发热病例BFV和RRV IgM抗体,BFV IgM抗体阳性4例,阳性率1.96%,RRV阳性6例,阳性率2.94%;②共检测426例病毒性脑炎病例BFV和RRV IgM抗体,BFV IgM抗体阳性12例,阳性率2.82%,RRV阳性15例,阳性率3.52%;③共检测870份健康人群BFV、RRV IgG抗体,BFV IgG抗体阳性率1.49%,RRV IgG抗体阳性率1.15%;④地区分布显示,2005-2008年BFV、RRV IgM抗体阳性病例数和分布县数呈逐年增加趋势。结论贵州省可能存在由BFV和RRV感染引起的疾病,应加强对这两种病毒引起的相关疾病监测和研究工作。

基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体的构建

目的:以semliki森林病毒复制子为基础,构建一类可迅速高效表达shRNA的新型RNAi载体。方法:以Semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1为骨架,用CMV IE启动子替换SP6启动子并在3′-UTR下游插入SV40 polyA转录终止子,在原26S亚基因组启动子后插入带有相应改良多克隆位点的shRNA表达元件,同时加入抗新霉素选择复合体,并去掉3′-UTR的重复序列。所获载体用于沉默EGFP基因,通过体外细胞转染、病毒颗粒制备、荧光显微镜观察、RT-PCR分析等初步验证、评估其效果。结果:构建了基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体pSFV-RNAi Ready。经体外实验初步证实,该载体直接转染细胞,或与辅助载体共转染,制备成具有感染能力的重组病毒颗粒后使用,均可高水平表达shRNA,沉默目的基因。其中使用病毒颗粒抑抑效率可高达90%以上。结论:该载体的成功构建,可望显著拓宽SFV载体的应用范围,丰富RNAi实施手段,并用于相关科学研究及基因药物技术开发。

塞姆利基森林病毒翻译增强序列对HIV Gag DNA疫苗抗原表达和免疫原性的调节

目的研究塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)衣壳蛋白5′翻译增强区对基于该病毒复制子的HIVGagDNA疫苗抗原表达水平和免疫原性的影响。方法将SFV衣壳蛋白(capsid,C蛋白)基因的5′端102bp翻译增强区插入到SFV复制子DNA疫苗载体pCMVRep的SFV亚基因启动子下游,得到DNA疫苗载体pCMVRepC。将删除ATG的HIV1gag基因插入pCMVRepC,使gag编码区与翻译增强区融合,得到DNA疫苗质粒pCMVRepCgag。同时,构建携带未融合翻译增强序列的DNA疫苗质粒pCMVRepgag。Westernblot检测翻译增强序列对Gag表达水平的影响。用上述两种DNA疫苗分别免疫BALBc雌性小鼠,ELISA检测Gag特异的抗体反应,ELISPOT和细胞内因子染色技术检测细胞免疫应答。结果衣壳蛋白5′翻译增强区增强了Gag表达水平,对体液免疫应答没有显著影响,但显著增强了特异性细胞免疫应答水平。结论SFVC蛋白翻译增强区能显著提高SFV复制子DNA疫苗的抗原表达和抗原特异性细胞免疫反应。

云南森林脑炎病毒的调查

通过 1988～ 1994年对云南森林脑炎病毒流行病学调查、病毒的普通生物学及分子生物学特性研究 ,首次发现云南高黎贡山存在森林脑炎病毒的自然疫源地 ,经病毒分离及血清学检测 ,推测卵形硬蜱为其主要传播媒介 ,鼠类动物为其主要贮存宿主。对人可引起高热、皮疹等全身感染症状。云南森林脑炎病毒与东北森林脑炎病毒相比较 ,云南毒株毒力稍低 ,对各种动物的致病性相似 ,但又有明显的出血现象。血凝的最适pH基本一致。云南森林脑炎病毒与东北标准株的多肽成分分析略有不同。云南高黎贡山的自然地理景观与东北大小兴安岭的地理景观不同 ,这与其毒株之间的差异可能有关。血清学调查显示云南大部分地区可能存在森林脑炎病毒。

我国新分离森林脑炎病毒E基因特征分析

为了解分离自黑龙江省大兴安岭林区全沟硬蜱中的DXAL-5、12、13、16、18、21共6株森林脑炎(TBE)病毒E蛋白基因特征并确定病毒基因型,应用RT-PCR技术对6株病毒E蛋白基因进行体外扩增、克隆、测序。结果发现,6株病毒E蛋白基因的核苷酸序列长均为1488bp,推导的氨基酸序列长均为496aa。与TBE参考毒株E蛋白基因进行比较,这6株病毒与远东亚型同源性最高,其次是西伯利亚亚型,与欧洲亚型同源性最差;在决定亚型特征的氨基酸位点多数属于TBE病毒远东亚型。E蛋白基因推导的氨基酸种系发生树分析表明,6株病毒均在远东亚型分枝内。因此就E蛋白基因而言,DXAL-5、12、13、16、18、21株均属于TBE病毒的远东亚型。新分离毒株与Senzhang株同源性较高,种系发生关系也比较接近,推测疫苗株对新分离毒株仍具有很好的保护作用。但是在E蛋白的A、B和C抗原决定区内,6株病毒均有不同程度的氨基酸改变,这些突变有可能影响E蛋白的功能。

首次从啮齿类和食虫类动物中分离到森林脑炎病毒

1988年,我们从采自云南高黎贡山的卵形硬蜱及患者血液中分离到森林脑炎病毒。1990年,又从该地区10种95只啮齿类中查到森林脑炎病毒抗体;并从社鼠(R.confucianus)、小林姬鼠(A.sylvaticus)和灰腹鼠(R.eha ninus)等8种啮齿类及食虫类中分离到15株病毒,选三株用单克隆抗体进行免疫荧光试验、理化特性、生物学特性及中和试验研究。结果表明,其病毒的抗原性、生物学特性及理化特性与东北株及从卵形硬蜱、患者分离的森林脑炎病毒一致。从啮齿类及食虫类分离到森林脑炎病毒在国内属首次报道。这项研究结果进一步证明,啮食类和食虫类在森林脑炎自然疫源地的保存方面起重要作用。

我国森林脑炎病毒森张株编码区序列测定

为鉴定我国森林脑炎病毒亚型,了解基因组结构与生物功能的关系,同时为森林脑炎病毒新型疫苗研制打下基础,对森林脑炎病毒森张株编码区序列进行测定。根据已发表的sofjin-HO、Oshima5-10株序列设计9对重叠引物,通过RT-PCR扩增不同的cDNA片段,分别克隆至pGEM-T载体,转化DH5α菌,挑阳性克隆PCR、酶切鉴定后测序。结果表明森张株编码区全长10 245nt,编码3414个氨基酸。我国森林脑炎病毒森张株与Oshima5-10、sofjin-HO、sofjin同源性最近,属于远东亚型。

森林脑炎病毒感染致视神经炎的远期疗效观察

目的:探讨森林脑炎病毒致视神经炎的远期疗效。方法:对森林脑炎病毒感染导致眼部病变患者中存在视神经炎改变的27例患者进行观察,常规眼科视力、裂隙灯、眼底、视野、视觉电生理、荧光血管造影、免疫荧光血流测定等检查手段。结果:其27例患者视力从原有的光感提高到0.5以上者22例,治愈好转率达81%。结论:森林脑炎病毒是大兴安岭林区特发性的急性传染病,可侵犯眼部的神经、肌肉而引发眼科各种神经、肌肉的病变,而对其患有视神经病变的患者除常有治疗方法外,对森林脑炎病毒感染致视神经炎的患者,还有其独特的治疗方法。故能引起高度的关注。

云南森林脑炎病毒生物学性状研究

1989年从云南省怒江州捕获的两组卵形硬蜱和一高热患者血中分离到3株病毒,对乳小白鼠和鸡胚敏感,并能在多种组织培养细胞上增殖产生病变。能凝集多种动物红细胞,血凝最适pH为6.2和6.6。电镜观察病毒呈球形,有包膜,直径40～62nm.不耐酸,不耐乙醚,属RNA病毒。保护力试验表明森林脑炎病毒免疫血清对新分离株有保护作用,经交叉血抑试验、交叉中和试验鉴定属披膜病毒科黄病毒属蜱媒脑炎亚组中的森林脑炎病毒。

森林脑炎病毒疫苗株的全基因组序列分析

实验设计针对森林脑炎病毒的特异性引物,以被森林脑炎疫苗株病毒感染的鼠脑组织中提取的总RNA为模板,用PCR方法分段逆转录合成、扩增序列并测序,应用DNASTAR软件比较分析。结果表明,该病毒疫苗株的全基因组由10782个核苷酸组成,编码3414个氨基酸。森林脑炎疫苗株病毒全基因序列的测定,为研究该病毒疫苗株的生物学特性提供了分子基础。