森林脑炎病毒包膜糖蛋白胞外区的表达、纯化及免疫原性分析

目的构建森林脑炎病毒(TBEV)森张株包膜糖蛋白E胞外区的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中诱导表达、纯化及初步分析其免疫原性。方法从GenBank下载TBEV森张株E蛋白胞外区基因序列(Eecto),密码子优化后交由公司合成,通过双酶切的方法克隆至pET28a载体,获得重组质粒pET28a-TBEV-Eecto。经过酶切和测序分析后,将正确的重组质粒转化BL21(DE3)感受态,用1 mmol/L异丙基-β-D-硫化半乳糖苷诱导表达后通过SDS-PAGE分析重组E蛋白胞外区的表达形式。纯化的包涵体用6 mol/L盐酸胍进行变性溶解,用含有非表面活性剂NDSB-201的缓冲液进行复性,之后超滤浓缩、镍柱亲和层析纯化及蛋白印迹鉴定。将获得的纯化TBEV-Eecto蛋白免疫BALB/c小鼠,利用免疫血清进行蛋白印迹、免疫荧光实验分析其特异性。结果重组质粒pET28a-TBEV-Eecto经酶切后的片段与预期大小一致,测序分析正确。重组蛋白TBEV-Eecto主要以包涵体形式表达,经过盐酸胍变性溶解、NDSB-201复性、超滤及镍柱亲和纯化后获得纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blotting分析均显示其与预期大小一致。纯化的TBEV-Eecto蛋白免疫小鼠血清可特异性识别真核表达的TBEV-PrME蛋白,提示TBEV-Eecto具有良好的免疫原性。结论成功构建TBEV森张株E蛋白胞外区的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达。纯化的TBEV-Eecto蛋白具有较好的免疫原性,为森林脑炎的血清学诊断方法和亚单位疫苗研制提供了基础。

云南森林脑炎病毒的调查

通过 1988～ 1994年对云南森林脑炎病毒流行病学调查、病毒的普通生物学及分子生物学特性研究 ,首次发现云南高黎贡山存在森林脑炎病毒的自然疫源地 ,经病毒分离及血清学检测 ,推测卵形硬蜱为其主要传播媒介 ,鼠类动物为其主要贮存宿主。对人可引起高热、皮疹等全身感染症状。云南森林脑炎病毒与东北森林脑炎病毒相比较 ,云南毒株毒力稍低 ,对各种动物的致病性相似 ,但又有明显的出血现象。血凝的最适pH基本一致。云南森林脑炎病毒与东北标准株的多肽成分分析略有不同。云南高黎贡山的自然地理景观与东北大小兴安岭的地理景观不同 ,这与其毒株之间的差异可能有关。血清学调查显示云南大部分地区可能存在森林脑炎病毒。

我国新分离森林脑炎病毒E基因特征分析

为了解分离自黑龙江省大兴安岭林区全沟硬蜱中的DXAL-5、12、13、16、18、21共6株森林脑炎(TBE)病毒E蛋白基因特征并确定病毒基因型,应用RT-PCR技术对6株病毒E蛋白基因进行体外扩增、克隆、测序。结果发现,6株病毒E蛋白基因的核苷酸序列长均为1488bp,推导的氨基酸序列长均为496aa。与TBE参考毒株E蛋白基因进行比较,这6株病毒与远东亚型同源性最高,其次是西伯利亚亚型,与欧洲亚型同源性最差;在决定亚型特征的氨基酸位点多数属于TBE病毒远东亚型。E蛋白基因推导的氨基酸种系发生树分析表明,6株病毒均在远东亚型分枝内。因此就E蛋白基因而言,DXAL-5、12、13、16、18、21株均属于TBE病毒的远东亚型。新分离毒株与Senzhang株同源性较高,种系发生关系也比较接近,推测疫苗株对新分离毒株仍具有很好的保护作用。但是在E蛋白的A、B和C抗原决定区内,6株病毒均有不同程度的氨基酸改变,这些突变有可能影响E蛋白的功能。

我国森林脑炎病毒森张株编码区序列测定

为鉴定我国森林脑炎病毒亚型,了解基因组结构与生物功能的关系,同时为森林脑炎病毒新型疫苗研制打下基础,对森林脑炎病毒森张株编码区序列进行测定。根据已发表的sofjin-HO、Oshima5-10株序列设计9对重叠引物,通过RT-PCR扩增不同的cDNA片段,分别克隆至pGEM-T载体,转化DH5α菌,挑阳性克隆PCR、酶切鉴定后测序。结果表明森张株编码区全长10 245nt,编码3414个氨基酸。我国森林脑炎病毒森张株与Oshima5-10、sofjin-HO、sofjin同源性最近,属于远东亚型。

首次从啮齿类和食虫类动物中分离到森林脑炎病毒

1988年,我们从采自云南高黎贡山的卵形硬蜱及患者血液中分离到森林脑炎病毒。1990年,又从该地区10种95只啮齿类中查到森林脑炎病毒抗体;并从社鼠(R.confucianus)、小林姬鼠(A.sylvaticus)和灰腹鼠(R.eha ninus)等8种啮齿类及食虫类中分离到15株病毒,选三株用单克隆抗体进行免疫荧光试验、理化特性、生物学特性及中和试验研究。结果表明,其病毒的抗原性、生物学特性及理化特性与东北株及从卵形硬蜱、患者分离的森林脑炎病毒一致。从啮齿类及食虫类分离到森林脑炎病毒在国内属首次报道。这项研究结果进一步证明,啮食类和食虫类在森林脑炎自然疫源地的保存方面起重要作用。

森林脑炎病毒感染致视神经炎的远期疗效观察

目的:探讨森林脑炎病毒致视神经炎的远期疗效。方法:对森林脑炎病毒感染导致眼部病变患者中存在视神经炎改变的27例患者进行观察,常规眼科视力、裂隙灯、眼底、视野、视觉电生理、荧光血管造影、免疫荧光血流测定等检查手段。结果:其27例患者视力从原有的光感提高到0.5以上者22例,治愈好转率达81%。结论:森林脑炎病毒是大兴安岭林区特发性的急性传染病,可侵犯眼部的神经、肌肉而引发眼科各种神经、肌肉的病变,而对其患有视神经病变的患者除常有治疗方法外,对森林脑炎病毒感染致视神经炎的患者,还有其独特的治疗方法。故能引起高度的关注。

森林脑炎病毒疫苗株的全基因组序列分析

实验设计针对森林脑炎病毒的特异性引物,以被森林脑炎疫苗株病毒感染的鼠脑组织中提取的总RNA为模板,用PCR方法分段逆转录合成、扩增序列并测序,应用DNASTAR软件比较分析。结果表明,该病毒疫苗株的全基因组由10782个核苷酸组成,编码3414个氨基酸。森林脑炎疫苗株病毒全基因序列的测定,为研究该病毒疫苗株的生物学特性提供了分子基础。

云南森林脑炎病毒生物学性状研究

1989年从云南省怒江州捕获的两组卵形硬蜱和一高热患者血中分离到3株病毒,对乳小白鼠和鸡胚敏感,并能在多种组织培养细胞上增殖产生病变。能凝集多种动物红细胞,血凝最适pH为6.2和6.6。电镜观察病毒呈球形,有包膜,直径40～62nm.不耐酸,不耐乙醚,属RNA病毒。保护力试验表明森林脑炎病毒免疫血清对新分离株有保护作用,经交叉血抑试验、交叉中和试验鉴定属披膜病毒科黄病毒属蜱媒脑炎亚组中的森林脑炎病毒。

森林脑炎病毒地鼠肾细胞培养增殖动态及疫苗生产工艺改进的研究

为了解森林脑炎病毒的增殖动态 ,改进现有疫苗的生产工艺 ,将森林脑炎病毒感染地鼠肾细胞 ,控制不同的培养条件 ,以利病毒增殖 ,并于不同时间收获病毒液 ,测定病毒滴度。疫苗液用不同浓度的福尔马林灭活后 ,测定疫苗的保护指数。结果表明森张株病毒增殖高峰在 6 8～ 72h ,多次收获的病毒液及其病毒滴度、疫苗效力均优于现有疫苗 ,新工艺可提高病毒产量 。

森林脑炎病毒森张株5′端非编码区序列测定

为了解森林脑炎病毒森张株 5′端非编码区序列与生物特性的关系 ,从而为疫苗研制打下基础 ,对其核苷酸序列进行测定。采用RACE法进行RT PCR扩增 ,克隆法测序。结果表明 :森张株 5′ UTR长 12 9nt,与Sofjin HO、Os hima5 10、Vasilchenko、Neudoerfl、2 6 3、Hypr的同源性分别为 92 %、91%、89%、87%、87%、87%。森张株存在三处特异性变异C18→T、T3 0 →C及 4 9、5 0连续两个核苷酸缺失。本实验建立了一套相似 5′端非编码区序列测定方法 ;三处特异性变异可能影响到森林脑炎病毒森张株的转录。

森林脑炎病毒分子生物学研究进展

森林脑炎（ＴＢＥ）病毒是黄病毒科中的成员，象其它的黄病毒一样，基因组ＲＮＡ含有单个开放阅读框架，在基因组的５′端编码病毒的结构蛋白，在３′端编码非结构蛋白，翻译成聚蛋白后，通过细胞和病毒编码的蛋白酶裂解产生单个的病毒蛋白，成熟的病毒是由两个相关的Ｅ和Ｍ膜蛋白脂质包膜所包围的立体对称的核衣壳组成。包膜Ｅ蛋白在病毒的感染周期中对细胞的识别和穿入细胞具有极其重要的功能，同时Ｅ蛋白诱导保护性的免疫反应，Ｅ蛋白内某一位点单个氨基酸的改变可引起病毒毒力的改变。因此，对ＴＢＥ病毒分子生物学的研究有助于了解病毒与宿主细胞相互作用的机理，为病毒感染的异性诊断、疫苗的研制和抗病毒药物的设计提供理论依据。

森林脑炎病毒分子生物学研究进展

森林脑炎(TBE)病毒属黄病毒科,基因姐RNA含有单个开放阅读框架,5′端编码病毒的结构蛋白,3′端编码非结构蛋白。翻译成聚蛋白后,通过细胞和病毒编码的蛋白酶裂解产生单个的病毒蛋白。成熟的病毒是由两个相关的E和M膜蛋白脂质包膜所包围的立体对称的核衣壳组成。包膜E蛋白在病毒的感染周期中对细胞的识别和穿入细胞具有极其重要的功能,同时E蛋白诱导保护性的免疫反应,E蛋白内某一位点单个氨基酸的改变可引起病毒毒力的改变。因此,对TBE病毒分子生物学的研究有助于了解病毒与宿主细胞相互作用的机理,为病毒感染的特异性诊断、疫苗的研制和抗病毒药物的设计提供理论依据。

森林脑炎病毒基因组RNA的分离及其性质的研究

本文从森林脑炎病毒感染的鼠脑组织中直接抽提总核酸,经Sepharose 4B柱层析,将病毒RNA与细胞RNA分离。方法简便。分离的病毒RNA在260nm处有典型紫外吸收光谱,260/280nm的比值近似2,对RNa(?)敏感,有感染性。

森林脑炎病毒在几种细胞上空斑技术的研究及其应用

本文报道了森林脑炎病毒的空斑形成技术,将来源不同的森林脑炎东北株和云南株接种于BHK21细胞,恒河猴肾细胞（LLC-MK2）以及原代鸡胚纤维细胞（CEC）,用半微量甲基纤维素空斑形成试验,观察两株病毒在三株细胞上的敏感性空斑形成速率以及空斑形态;并将空斑中和实验的结果与小白鼠中和实验进行对比结果发现,在BHK21细胞空斑形成早,进展快,形态大而园,维持时间长,结果重复性好,是用于中和实验理想的细胞。CEC细胞出斑时间晚,维持时间长,不同的毒株在CEC细胞上空斑形态有明显的差异。

云南株森林脑炎病毒感染恒河猴的实验观察

为进一步了解云南省森林脑炎病毒的致病性和免疫反应性，用云南株森林脑炎病毒（ＹＨ株）皮下感染恒河猴，观察其发病情况、病毒血症、特异性抗体消长和组织器官的病理变化。结果恒河猴呈轻型感染，病毒血症期约一周，抗体效价高达１：６０，脑组织病理改变较轻。表明恒河猴对云南株森林脑炎病毒敏感。

首次从云南卵形硬蜱中分离到抗原性与森林脑炎病毒相似的两株病毒

森林脑炎又称蜱媒脑炎,是由蜱传播的一组疾病。云南省西部属西部亚热带雨林气候,动物地理划区为西南山地亚区,与缅甸相邻的横断山脉地段为原始针阔叶林混交地区。该地区的地理条件适合多种蜱生长,但是否存在某些未知的蜱媒病毒循环尚不清楚。1988～1989年,我们调查了该地区蜱媒病毒性疾病,从两组卵形硬蜱中分离到两株抗原性与森林脑炎病毒相似的病毒,首次证实在云南存在森林脑炎一类病毒的自然疫源地。

抗森林脑炎病毒单克隆抗体的研制

用BALB/c小鼠骨髓瘤细胞（Sp2/0）与经森林脑炎（RSSE）病毒免疫后的BA-LB/c小鼠的B淋巴细胞进行融合,获得一株能分泌抗RSSE病毒MCAd杂交瘤细胞,株名为4B6,血凝抑制试验（HI）和间接免疫荧光试验（IFA）均为阳性,MCAb培养上清效价前者为1:32-1:64,后者为1:16。MCAb腹水效价前者为1:128-1:320。

森林脑炎病毒E基因DomainⅢ段的克隆表达及鉴定

从森林脑炎病毒森张株的细胞培养液中提取总RNA,通过RT-PCR扩增E蛋白基因DomainⅢ段,克隆入原核表达载体GSTpET-30a(+)中,构建重组原核表达质粒,用IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后,进行Western blot鉴定,并用针对不同病毒的兔免疫血清验证其检测特异性。重组原核表达质粒GSTpET-30a-ED3经酶切证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为41 kD,主要以包涵体的形式表达,并可与TBE阳性兔免疫血清特异性反应。结果表明:成功克隆了森林脑炎病毒森张株E蛋白基因DomainⅢ段,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,获得的ED3蛋白质具有良好的特异性。

从云南蝙蝠及牛蜱中分离出两株森林脑炎病毒

1990年7月从捕自云南省临沦地区的微小牛蜱及大马蟑蝠脑组织中分离出两株病毒。对其进行了理化特性、电子显微镜、交叉血凝抑制、间接免疫荧光、交叉中和等试验的检测鉴定,结果表明这两株病毒为蜱媒森林脑炎病毒。对我省森林脑炎流行病学的研究具有重要参考价值。