PeroxiredoxinII在小鼠卵巢中卵泡、GV卵、MII卵和植入前胚的表达和定位

目的 观察PeroxiredoxinII在小鼠卵巢中卵泡和植入前胚的表达与定位 ,为探讨PeroxiredoxinII在小鼠卵母细胞发育成熟和早期胚发育的作用提供依据。 方法 根据小鼠PeroxiredoxinIImRNA序列 (AccessionNo :BC0 0 2 0 34)设计引物 ,对小鼠生发泡完整卵细胞 (GV卵 )中的PeroxiredoxinII可能编码区进行扩增。同时 ,取生后 3d和 2月小鼠的卵巢 ,免疫细胞化学染色显示PeroxiredoxinII蛋白在卵泡中的分布。此外 ,运用RT PCR和免疫细胞化学染色方法观察PeroxiredoxinII在植入前胚的表达。 结果 从GV卵中扩增所得 6 84bp的cDNA序列 ,与小鼠PeroxiredoxinII具有 99%同源性 ;其推导的编码氨基酸序列与小鼠PeroxiredoxinII氨基酸序列完全相同。免疫细胞化学染色显示 :生后 3d小鼠卵巢内未见PeroxiredoxinII阳性反应 ;2月小鼠卵巢内阳性反应见于初级卵泡、次级卵泡和近成熟卵泡中卵母细胞的胞质。卵泡细胞未见PeroxiredoxinII阳性反应。RT PCR结果表明 :PeroxiredoxinIImRNA在GV卵中处高水平 ,从MII卵开始略有下降 ,在 4 细胞胚和早期囊胚期间未检到。免疫细胞化学染色显示 :GV卵、MII卵、1 细胞胚、2 细胞胚、4 细胞胚、8 细胞胚、桑椹胚和早期囊胚均呈PeroxiredoxinII阳性反应。

成纤维细胞生长因子受体-1、2和3在昆明小鼠卵母细胞和植入前胚中的表达与分布

目的：观察成纤维细胞生长因子受体（FGFR）-1、2和3在昆明小鼠卵母细胞和植入前胚中的表达和分布，为进一步探讨成纤维细胞生长因子（FGF）对昆明小鼠卵母细胞和植入前胚发育的影响提供实验依据。方法：逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫荧光细胞化学显色和共聚焦扫描显微镜观察。结果：RT-PCR检测显示，FGFR1、FGFR2和FGFR3mRNA在昆明小鼠卵母细胞和植入前胚均有表达；免疫荧光细胞化学显色、共聚焦扫描显微镜观察显示FGFR1、FGFR3免疫阳性反应见于卵母细胞和植入前胚胞质周边，靠近细胞膜；FGFR2阳性反应较均匀分布于卵母细胞和植入前胚的胞质。结论：FGFR1、FGFR2、FGFR3在小鼠卵母细胞和植入前胚发育的不同阶段都有表达，可能介导FGF调节小鼠卵母细胞和植入前胚的发育。

FGF10对小鼠植入前胚体外发育及2-细胞胚内G蛋白偶联受体30表达的影响

目的观察成纤维细胞生长因子10(FGF10)对小鼠受精卵体外发育和2-细胞胚内G蛋白偶联受体30(GPR30)水平的影响,为进一步探讨FGF10在小鼠植入前胚体外发育中的作用提供依据。方法以M16培养液为对照组,M16中分别添加不同浓度的FGF10为实验组,收集昆明(KM)雌性小鼠与KM雄性小鼠交配所得的受精卵,分别观察各组受精卵体外发育情况。收集KM小鼠受精卵,分别置于M16和含不同浓度FGF10的M16培养液中培养,获取体外发育的2-细胞胚,采用免疫荧光染色结合激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内GPR30水平。结果添加FGF10实验组发育到4-细胞胚、桑葚胚和囊胚的比率明显高于对照组,其中以添加浓度为10ng/ml的FGF10实验组的效果最明显。免疫荧光染色结果显示,10ng/ml的FGF10实验组体外发育2-细胞胚内GPR30免疫荧光染色强度明显高于对照组。结论 FGF10可促进KM小鼠植入前胚的体外发育,其作用可能与上调2-细胞胚内GPR30有关。

小鼠GV卵中母源基因的克隆和其中一个基因在植入前胚表达的研究

目的 克隆和筛选小鼠生发泡完整卵母细胞 (GV卵 )中母源基因 ,并检测其中一个基因在植入前不同发育阶段胚中的表达 ,初步了解该基因在卵母细胞发育成熟及早期胚发育中的作用。 方法 应用抑制性消减杂交技术 (SSH) ,以生发泡完整的卵母细胞为检测子 (tester) ,8 细胞胚为驱赶子 (driver) ,建立GV卵中母源基因的cDNA文库。通过斑点杂交法进一步筛选GV卵中母源基因的cDNA文库 ,对阳性克隆进行序列测定和同源性分析 ;并采用RT PCR方法观察其中 1个阳性克隆的基因在着床前胚的表达。 结果 克隆得到 18个基因的cDNA序列和 8个同源EST序列在GV卵中特异表达 ,包括PeroxiredoxinⅡ基因。RT PCR显示PeroxiredoxinⅡ基因呈阶段性差异表达 ,在GV卵、MⅡ卵、1 细胞胚和 2 细胞胚有表达 ,但从MⅡ卵开始表达下降。而在 4 细胞胚、8 细胞胚、桑椹胚和囊胚中不表达。 结论 PeroxiredoxinⅡ基因是GV卵中母源基因cDNA文库中的一个基因 ,提示该基因在卵母细胞发育成熟和合子基因激活中起一定作用。

p-CREB在小鼠植入前胚的表达及其与2-细胞阻滞的关系

目的观察p-CREB在小鼠植入前胚以及阻滞品系(昆明小鼠)与非阻滞品系(B6C3F1小鼠)2-细胞胚的分布与表达,初步探讨p-CREB在小鼠植入前胚中的作用以及与小鼠2-细胞阻滞的关系。方法利用激光扫描共聚焦显微镜检测p-CREB在B6C3F1小鼠植入前胚中的定位,比较不同品系小鼠体外培养以及B6C3F1小鼠体外培养与体内发育2-细胞胚内p-CREB的表达变化。结果p-CREB的免疫阳性反应在小鼠1-细胞胚中主要分布于细胞质中;2-细胞胚及其后期植入前胚主要定位于细胞核内;昆明小鼠体外培养2-细胞胚核内荧光强度显著低于同一条件发育的B6C3F1小鼠,B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚核内荧光强度显著高于体内发育。结论p-CREB在小鼠植入前胚发育中起重要作用,p-CREB在昆明小鼠2-细胞胚核内表达较低可能与小鼠2-细胞阻滞有关。

雌激素受体α及其靶基因c-Myc与植入前胚

雌激素受体α(ERα)属于类固醇激素受体超家族,是细胞核中需要配体激活的转录因子,对细胞和组织的增殖、分化和发育有重要的调节作用。c-Myc是ERα目的基因,属于Myc基因家族,是一种核蛋白类的原癌基因。ERα调控着c-Myc的表达,而c-Myc的表达变化也影响着ERα的功能发挥,彼此之间存在关联。它们在哺乳动物植入前胚中呈阶段特异性表达,在植入前胚发育中发挥一定作用。

转录因子SNAIL在小鼠植入前胚中的表达及作用

干细胞工程与再生医学福建省高校重点实验室母型向合子型过渡(MTZ)是哺乳动物胚胎发育的关键事件,合子基因组激活(ZGA)作为母型向合子型转化的重要一步,具体机制有待于进一步的研究。Snail作为Snail家族的成员之一,在上皮细胞-间充质转化(EMT)和胚胎发育方面有重要的作用。本研究主要通过观察Snail在小鼠植入前胚不同阶段的定位及mRNA水平的变化,并利用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制其基因的表达,研究Snail在小鼠植入前胚发育过程中的作用。结果显示,Snailm RNA水平在1-细胞胚表达最高,随后逐渐降低;Snail蛋白于2-细胞胚后期直到桑椹胚前期定位于胞核,而囊胚分布于胞质。

ERα特异性抑制剂对KM小鼠植入前胚体外发育的影响

目的探讨ERα在KM小鼠植入前胚体外发育中的作用。方法以空白M16培养液为对照组,观察不同浓度的ER抑制剂(ICI182780)、ERα特异性抑制剂(MPP)、ERβ特异性抑制剂(PHTPP)和ERα特异性抗体对KM小鼠1-细胞胚体外发育至4-细胞胚和囊胚的影响。结果与M16对照组比较,0.5和1μmol/L的ICI182780、10μmol/L的MPP明显降低4-细胞胚的发育率,导致囊胚发育失败(P<0.01);25和50μmol/L的MPP、1μg/m L的ERα特异性抗体将1-细胞胚阻滞在2-细胞阶段,并且50μmol/L的MPP对细胞有毒性作用(P<0.01);0.5μg/m L的ERα特异性抗体使细胞丧失发育至囊胚的能力(P<0.01);各浓度的PHTPP均未被观察到有上述作用(P>0.05)。结论 ER抑制剂、ERα特异性抑制剂和ERα特异性抗体均能抑制小鼠1-细胞胚的体外发育。

PeroxiredoxinⅡ在小鼠早胚发育中的作用及机理

目的观察PeroxiredoxinⅡ对小鼠植入前胚发育的影响,并探讨其可能的机制。方法收集昆明种小鼠的1细胞胚,采用微滴培养法连续培养48h,观察不同浓度PeroxiredoxinⅡ抗体对植入前胚发育的影响,以胚胎发育到各期的比例为判断发育效果的标准。同时,应用共聚焦扫描显微镜术结合特异性荧光探针2′,7′二氯氢化荧光素双乙酸酯,检测小鼠胚中氧自由基水平。结果抗体添加组和未添加组的1细胞胚经24h培养后96%以上发育成2细胞胚,但经48h培养,抗体添加组的胚发育明显受抑,多数停滞于2细胞期。激光共聚焦成像的结果表明,PeroxiredoxinⅡ抗体添加组的2细胞胚内荧光强度明显增强。结论PeroxiredoxinⅡ抗体可引起2细胞胚发育阻滞,这可能与胚内的氧自由基水平升高有关,提示植入前胚内PeroxiredoxinⅡ可减少或消除细胞内氧自由基,促进植入前胚的发育。

ERα特异性抑制剂MPP降低小鼠2-细胞胚G1/S期过渡相关因子Nanog、cyclin D1和cyclin E水平

目的观察雌激素受体(ERa)特异性抑制剂甲基哌啶吡唑(methyl-piperidino-pyrazole,MPP)对小鼠2-细胞胚G1/S期过渡相关因子Nanog、cyclin D1和cyclin E表达水平的影响,阐明ERa对小鼠2-细胞胚G1/S期过渡的作用,为进一步探讨ERa在小鼠植入前胚合子基因组激活中的作用机制提供理论依据。方法收集昆明雌性小鼠与雄性小鼠交配所得的受精卵,分别置于无MPP的培养液和含20mmol/L MPP的培养液中培养,获取体外发育的2-细胞胚,采用免疫荧光染色技术检测细胞内Nanog、cyclin D1和cyclin E水平。结果免疫荧光染色结果显示,含20mmol/L MPP培养液培养的受精卵其体外发育2-细胞胚内Nanog、cyclin D1和cyclin E免疫反应性明显降低。结论 ERa可通过调控小鼠2-细胞胚内Nanog、cyclin D1和cyclin E水平,影响细胞从G1期到S期的过渡。

阻滞和非阻滞品系小鼠体外发育2-细胞胚基因表达水平的比较

检测阻滞品系昆明小鼠和非阻滞品系B6C3F1小鼠体外发育2-细胞胚内基因表达水平的差异，探讨昆明小鼠植入前胚体外发育阻滞与哪些基因表达调控有关。方法：分别收集昆明小鼠和B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚，运用基因芯片分析和Real-timePCR验证。结果：基因芯片检测共筛出差异表达基因303个，其中昆明小鼠2-细胞胚表达上调基因有168个；下调基因有135个。昆明小鼠2-细胞胚表达上调的基因以信号转导、细胞周期、细胞结构和运动、细胞增殖和分化以及发育进程等为主；而下调基因与电子转移、蛋白质代谢和修饰、氨基酸代谢以及蛋白质靶向运输和定位等相关。结论：胚内能量供应不足和蛋白质合成障碍可能是昆明小鼠植入前胚体外发育出现2-细胞阻滞的重要原因。

小鼠紧密化8-细胞胚cDNA文库的构建及其阶段特异性cDNA克隆的差示筛选

从小鼠紧密化８－细胞胚构建ｃＤＮＡ文库，采用差示筛选法比较了紧密化８－细胞胚与晚期２－细胞胚在基因表达上的差异。结果显示：两者存在着ｍＲＮＡ序列种类及数量的明显不同，并获得了两个仅存在紧密化８－细胞胚阶段的ｃＤＮＡ克隆。推测其功能可能与植入前胚细胞分化的调控有关。