(七)植入前胚胎遗传学诊断知情同意书

我们夫妻因______(适应证)于_______生殖医学中心(以下简称生殖中心)接受植入前胚胎遗传学诊断(PGD)技术助孕。PGD技术目前是由胚胎植入前非整倍体遗传学检测(PGT-A)、胚胎植入前染色体结构变异遗传学检测(PGT-SR)、胚胎植入前单基因遗传学检测(PGT-M)等技术构成。

单个植入前胚胎mRNA差异显示方法的建立

在已有的研究基础上 ,优化和建立了单个植入前胚胎的mRNA差异显示 (singlepreimplantationembryodifferentialdisplaypolymerasechainraction ,SPEDDRT PCR) .以小鼠单个成熟的卵母细胞和单个的 2细胞期胚胎作为起始材料 ,比较二者之间基因的表达差异 .选择在卵母细胞中不表达而在 2细胞期表达的差异片段 .进行GenBank检索和表达序列标签 (EST)库电子克隆 .与多胚研究方法一样 ,由线粒体编码的和 2细胞特异表达的NADH脱氢酶亚单位 2和ATPase 6证实了SPEDDRT PCR方法是可行而且可靠的 ,是一种需要材料极少。

GRIM-19在小鼠植入前胚胎中的表达及其作用

目的通过研究干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因(GRIM-19)在小鼠植入前胚胎中的表达及其与胚胎质量之间的相关性,探讨GRIM-19在小鼠植入前胚胎发育中的作用。方法采用实时定量PCR,检测小鼠植入前胚胎(2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期、桑葚胚和囊胚)中GRIM-19 mRNA水平(n=16);将小鼠8-细胞期胚胎按卵裂球大小、形态、透明带、胞质碎片分为优胚组和非优胚组,分别检测两组胚胎GRIM-19mRNA水平,并分析其相关性(n=13);制作假孕鼠(23只),并随机分为A组(12只)和B组(11只),采用移植器将优质和非优质8-细胞期胚胎移入假孕鼠的子宫内,观察两组雌鼠妊娠率及产仔率。结果 GRIM-19在小鼠植入前各期胚胎中均有表达,其mRNA水平从2-细胞期逐渐增高,至8-细胞期达高峰,随后呈下降趋势。优质8-细胞胚胎的GRIM-19 mRNA水平明显高于非优胚组(P<0.05)。两组8-细胞胚胎移植后,A组雌鼠妊娠率及产仔率显著高于B组雌鼠(P<0.05)。结论小鼠植入前胚胎中GRIM-19的表达量随发育时程的改变而变化,且与胚胎质量密切相关。

单个植入前胚胎构建cDNA文库

以PCR为基础的单个植入前胚胎cDNA文库构建是一种快速、可重复和高效的建库方法。单个植入前胚胎cDNA文库作为一种重要的新兴基因资源库 ,为新基因的克隆和鉴定奠定了坚实的基础 ,不仅解决了胚胎研究材料受限的问题 ,而且在时间上更加精确 ,更符合胚胎发育的规律。是研究早期胚胎发育基因表达的一种有效手段。随着这一技术的不断改进和与其它技术的有机结合 ,必然为人们进一步揭示胚胎发育的分子机制开创一个崭新的局面。

小鼠单个植入前胚胎cDNA文库的构建及应用

哺乳动物合子基因组激活和植入前胚胎阶段特异性表达基因的研究一直是发育生物学研究的重点。发现和克隆植入前胚胎阶段特异性表达的基因需要有效的方法 ,阶段特异性cDNA文库的构建和筛选是一种较好的方法。用小鼠单个成熟卵细胞、受精卵、2 细胞、4 细胞和 8 细胞胚胎分别构建了cDNA文库。滴度分别为 :6 2× 1 0 5、8 3× 1 0 5、1 0 4× 1 0 6、1 5 1× 1 0 6和 1 62×1 0 6。随机挑选了 2 9个克隆并进行了序列分析 ,结果表明 ,和已知表达序列标签 (ESTs)同源的序列为 65 5 2 % ( 1 9 2 9) ,未知序列为 1 3 79% ( 4 2 9) ,并发现了 2个重复序列。用特异性引物 ,分别对小鼠持家基因 ( β actin)和发育特异基因 (OCT 4)进行PCR扩增 ,结果表明 ,所建立的cDNA文库可以反映小鼠胚胎在不同发育阶段整个基因群体的转录活性 。

小鼠植入前胚胎GCN5和HDAC1表达模式及体外培养对其表达的影响

为探讨小鼠植入前胚胎组蛋白乙酰化酶GCN5(general control of nucleotide synthesis,GCN5) 和组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetyluse1,HDAC1)的表达模式及常规体外培养对它们表达的影响,应用荧光免疫细胞化学技术,检测了体内和体外培养的小鼠2、4、8细胞期卵裂胚胎、桑葚胚和囊胚GCN5和HDAC1的表达。结果显示,GCN5在体内组各细胞期卵裂胚胎和桑葚胚的细胞浆内均呈高表达,细胞核内未见明显表达,而囊胚细胞的细胞浆和细胞核内均无表达:HDAC1在体内组小鼠2细胞期胚胎中以细胞浆内表达为主,在其他各期胚胎均以细胞核内表达为主．囊胚期内细胞团部分细胞的细胞核内未见HDAC1表达。GCN5在体外组小鼠植入前各期胚胎均不表达,而 HDAC1的表达强度明显低于体内组的。提示体外培养抑制小鼠植入前胚胎GCN5和明显降低 HDAC1的表达,影响胚胎基因的正确性表达。

印迹基因Snrpn在人类卵母细胞及植入前胚胎mRNA表达

目的了解印迹基因Snrpn在人类卵母细胞和植入前胚胎的表达,以分析Snrpn基因表达对人类卵母细胞和早期胚胎发育的影响。方法采用单细胞巢式逆转录多聚酶链式反应(Single Cell Nested RT-PCR)方法,检测人类卵子和植入前各个阶段胚胎的印迹基因Snrpn mRNA表达情况。结果Snrpn在人类卵母细胞GV、MI、MII和植入前胚胎2、4、6、8细胞期都有表达,单卵母细胞扩增成功率为87.5%,单个胚胎为75.8%,平均扩增成功率为79.1%。单个卵母细胞和单个卵裂球扩增成功率无显著性差异(P>0.05),但单卵母细胞较单个卵裂球高。结论建立了比较稳定、可靠的单细胞巢式RT-PCR技术检测基因表达。印迹基因Snrpn在人类卵细胞和植入前胚胎的表达对卵子生长和胚胎发育有着重要意义。

人类植入前胚胎形态与染色体异常关系初探

【目的】探讨人类植入前胚胎发育及形态与染色体异常之间的关系。【方法】对6例染色体异常患者的67个胚胎进行植入前遗传学诊断,对其进行形态评定,并用荧光原位杂交方法对胚胎进行染色体分析,分为染色体正常胚胎组及异常组。【结果】分析的67个胚胎中,染色体正常16个,异常51个。染色体正常及异常的胚胎在取卵后72h发育至6细胞以上的比率分别为68.75%,62.75%;正常与异常的胚胎中碎片均<20%的胚胎分别占100%、94.12%;胚胎活检后继续发育率分别为73.33%,79.54%;差异均不具显著性。【结论】用荧光原位杂交方法可对植入前胚胎进行染色体分析并研究早期胚胎形态与染色体异常之间的关系。

小鼠单个植入前胚胎SSH方法的可行性

为建立一种能够一次性分离任意两个植入前胚胎之间全部的差别表达的基因的方法 ,在已有的单胚胎操作技术的基础之上 ,对单个植入前胚胎抑制性消减杂交 (singlepreimplantationembryosuppressionsubtractivehybridization ,SPE SSH)方法进行了初步的探索 ,分离到OM2和MⅡ d 2的基因片段 ,经GenBank和文献检索发现 ,这两个基因具有在MⅡ期和 2细胞期特异性表达的特点 .利用cDNA阵列所进行的鉴定也获得了同样的结果 ,而且所使用的材料极少 ,说明SPE SSH是一种强有力的分离和识别早期发育相关基因片段的实验技术 .若与单个卵裂球分离技术相结合 。

葡萄糖代谢对卵母细胞成熟和植入前胚胎发育的影响

葡萄糖主要通过糖酵解途径、磷酸戊糖途径、己糖胺生物合成途径和多元醇途径进行代谢,在卵母细胞发育成熟及植入前胚胎发育过程中起重要作用。葡萄糖代谢异常,可导致卵母细胞成熟障碍和胚胎发育异常。本文对上述四条葡萄糖代谢途径在卵母细胞和植入前胚胎发育过程中的作用进行综述。进一步研究卵母细胞成熟和植入前胚胎发育过程中葡萄糖代谢途径的调控机制,有利于改善卵母细胞体外成熟和胚胎的培养条件,提高体外培养的卵母细胞和胚胎的发育能力。

人植入前胚胎细胞凋亡的细胞化学检测

目的 建立原位末端标记法（TdT-mediated nick end labeling，TUNEL）检测人植入前胚胎凋亡征象的方法。方法取试管婴儿助孕技术后异常受精的3原核胚胎，于2～10细胞期进行固定，采用TUNEL法检测3原核胚胎中的凋亡征象。结果在发育正常和发育停滞胚胎中，未检测到凋亡征象；在20％有碎片的胚胎中检测到TUNEL阳性信号。结论采用TUNEL法可以有效检测人植入前胚胎中的凋亡征象，细胞碎片的出现可能与凋亡有关。

生长因子在植入前胚胎的表达及作用

哺乳动物植入前胚胎可合成并分泌多种肽类细胞因子胰岛素样生长因子(IGFS),转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)、白血病抑制因子(LIF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等,上述因子的受体在胚胎和母体中也有表达。它们在激素的调节下,通过自分泌和旁分泌的形式作用于自身和母体,从而在胚胎生长、发育方面发挥重要作用。

干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因-19在小鼠植入前胚胎中的表达

目的研究干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因-19(GRIM-19)在小鼠植入前胚胎中的表达情况,探讨GRIM-19在早期胚胎发育中的动态变化。方法采用Western blot分析和Real-time PCR检测小鼠植入前胚胎(2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期、桑葚胚和囊胚期)中GRIM-19蛋白和mRNA水平。结果 GRIM-19在小鼠植入前各期胚胎中均有表达,其蛋白和mRNA水平从2-细胞期逐渐增高,至8-细胞期达高峰,随后呈下降趋势。结论小鼠植入前胚胎中GRIM-19的表达量随发育时程的改变而改变,提示GRIM-19在早期胚胎发育过程中具有一定的作用。

小鼠植入前胚胎紧密化相关基因Crg1的克隆

从已获得的运用抑制消减杂交技术 (SuppressionSubtractiveHybridization ,SSH)分离、克隆和筛选代表 8 细胞早期胚胎和紧密化 8 细胞胚胎差别表达基因的ESTs片段 (GenBank登录号 :BQ740 2 63、BQ740 2 51)入手 ,经比较二者的同源性发现这两个EST末端反向互补 ,拼接成一个cDNA片段 ,经分析此序列包含一个完整的阅读框 ,提交给GenBank ,登录号为AY13 4 859。根据此序列设计引物从小鼠 8 细胞紧密化胚胎cDNA中经PCR扩增出目的片段 ,克隆入pUCm T载体后测序而获得全长cDNA ,为小鼠植入前胚胎紧密化相关基因Crg1,分析比较证明Crg1基因与AY13 4 859基本吻合。Crg1基因的cDNA全长为 810bp ,只有一个外显子 ,编码由 150个氨基酸组成 ,分子量理论值为 17 67kD的蛋白质。与最新的小鼠基因组工作草图进行电子杂交 ,该基因被定位在小鼠的 14号染色体上。RT PCR实验证明在小鼠植入前各个时期的胚胎、小鼠胚胎干细胞中均有表达 ,在小鼠胚胎成纤维细胞中没有表达。半定量RT PCR实验证明Crg1基因在紧密化胚胎中表达较 8 细胞胚胎高。采用Northern blot手段分析Crg1基因在成年小鼠的 8种组织中的表达情况 ,结果表明该基因只在小鼠卵巢中有微弱的表达 ,转录本大小为 1 2kb ,而在成年小鼠的脑、心脏、肾、睾丸、肝脏、肺、

早期卵裂环境与小鼠植入前胚胎GCN5和HDAC1表达的研究

应用免疫细胞化学技术对体内、外组小鼠植入前胚胎组蛋白乙酰基转移酶GCN5(generalcontrolofnucleotidesynthesis,GCN5)和去乙酰化酶HDAC1(histonedeacetylase1)的表达情况进行测定研究。结果显示(1)体内组:GCN5在2细胞、4细胞、8细胞卵裂胚胎和桑椹胚的胞浆内为强荧光信号;而囊胚细胞的胞浆无明显荧光信号。HDAC1在2细胞的胞浆胞核内均有荧光信号,但以胞浆内为著;4细胞、8细胞、桑椹胚和囊胚的胞核内可见HDAC1强荧光信号。(2)体外组:2细胞、4细胞、8细胞、桑椹胚和囊胚的胞浆胞核均无明显的GCN5荧光信号。HDAC1在各细胞期胚胎的染色情况与体内组基本相似,只是荧光强度有所下降,尤其是2细胞胚胎。结果表明:早期卵裂环境影响小鼠植入前胚胎GCN5和HDAC1表达。

GFs、INGs在植入前胚胎发育中的作用

植入前胚胎发育到4细胞阶段前，其基因主要受来源于母源的基因组调控，发育到8细胞阶段后，才开始受到胚胎源基因组转录的调控。胚胎源基因组的启动标志着早期胚胎自身转录调控的开始，该生物学过程受到许多因子的调控。该文就生长因子（GFs）、生长抑制因子（INGs）的表达及其对植入前胚胎发育的作用等研究进展作以综述。

体外培养对小鼠植入前胚胎DNA甲基转移酶表达模式影响的研究

目的研究小鼠植入前胚胎DNA甲基转移酶（Dnmt）1和3b的表达模式及体外培养对其表达的影响。方法应用荧光免疫细胞化学法检测在体内和体外培养的小鼠植入前胚胎Dnmtl、Dnmt3b的表达。结果Dnmtl、Dnmt3b在体内组2、4、8细胞胚胎和桑椹胚的胞浆内均呈高表达，在囊胚期则为胞浆内低表达，而核内均无明显表达；Dnmtl、Dnmt3b在体外组囊胚期前胚胎的表达模式均与体内组相似，为胞浆内高表达，而囊胚期则为胞核内低表达。结论体外培养改变了小鼠囊胚期Dnmtl、Dnmt3b的表达模式，影响基因的表达水平和表达模式。

不同印迹基因在人类不同阶段卵母细胞及植入前胚胎的表达及意义

目的:研究印迹基因lgf2r、H19、RB1、IPW在人类卵母细胞及植入前胚胎的表达,完善印迹基因在人类种植前胚胎的表达图谱。方法:应用RT-PCR技术检测目前尚未有明确报道在人类卵子及胚胎有正常表达的4条印迹基因在卵子和胚胎中的表达情况。结果:IPW在单个不同阶段卵母细胞和各期种植前胚胎均表达,其余在卵子和各期种植前胚胎均无明显表达。而4条目的基因在阳性对照人子宫内膜组织中均正常表达。结论:IPW在卵子和各期种植前胚胎均表达,其余在在卵子和各期种植前胚胎均无明显表达。完善印迹基因在人类种植前胚胎的表达图谱,尤其单细胞的研究,更有助于开展种植前遗传学诊断,为探讨印迹基因与辅助生殖、先天性印迹疾病以及肿瘤的关系提供理论依据。

双光子激发荧光成像技术对小鼠植入前胚胎的实时观测

双光子激发的蓝移效应可使利用同一束超快激光同时激发多种不同荧光特性的生物荧光染料的设想得以实现。选取锁模飞秒掺钛蓝宝石(Ti-sapphire)激光器输出的730nm激光,分别激发Hoechst33342,Fluo-4,PI和Indo-1四种常用生物荧光染料,分别利用(455±15)nm,(540±15)nm,(580±16)nm和(500±15)nm四种滤光片获得特异性荧光图像。结合双光子激发荧光成像技术穿透深,光损伤小,信噪比好等优势,选取合适的荧光染料组,应用单束激光激发、双染双通道成像方法,对小鼠植入前胚胎内细胞中的钙信号和染色体进行三维、四维实时成像,为探究小鼠植入前胚胎发育规律提供一种全新的多参数观测手段。