植块法与酶消化法结合培养原代大鼠雪旺细胞

目的:探讨利用植块法与酶消化法相结合培养大鼠原代雪旺细胞的可行性,并研究其增殖规律。方法:取10只新生2～3d的SD大鼠双侧坐骨神经,剥除神经外膜,剪成约1mm3大小的碎块,用0.03%胶原酶和0.25%胰蛋白酶按1∶2对神经碎块消化12min,加入少量含10%胎牛血清的DMED培养基小心吹打细胞及组织块,再植于培养皿中培养。用S-100免疫组化染色鉴定雪旺细胞,结合Hoechst3342染色计算其纯度,在显微镜下确定细胞数量。结果:在植块培养24h后即有大量细胞迁出,2～6d细胞生长迅速,10d以后生长较为缓慢,其倍增时间为2.3d。经S-100染色证实所培养细胞为雪旺细胞,结合Hoechst3342染色可得其培养8d时纯度为95.1%,传代后纯度可达96.3%。10只新生鼠培养12d后可得细胞数约为4.8×106个。结论:利用植块法与酶消化法相结合的方法可以迅速获得大量高纯度的雪旺细胞,其增殖速度在前6d最快,倍增时间为2.3d。

应用植块法培养人脐动脉平滑肌细胞

目的 应用植块法培养人脐动脉平滑肌细胞。方法 取人脐动脉,去除内外膜,剪成1mm^3左右的小块等距均匀种植,用含20％小牛血清BMEM液培养。结果 4 d时可见组织边缘处有细胞游出,2～3周后细胞融合生长,呈“峰谷”状生长,经抗免疫组化、电镜鉴定为平滑肌细胞。结论 应用植块法培养人脐动脉平滑肌原代细胞简单易行、纯度高,具有实际意义。

植块法在成骨细胞培养中的应用

目的:探讨植块法培养成骨细胞的可行性。方法:取10例先天性脊柱侧凸患者髂骨松质骨,应用植块法分离培养成骨细胞。培养过程中观察细胞形态学变化,并用碱性磷酸酶染色、RT-PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙素表达、骨钙素免疫荧光检测、钙结节观察等方法对培养细胞进行鉴定。结果:应用植块法培养获得了较多的原代细胞,光镜下呈典型的成骨细胞形态,碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原和骨钙素表达及钙结节形成等观察结果均证实所培养细胞表现成骨细胞特性。结论:植块法成骨细胞培养体系方法简单,在获得大量原代成骨细胞的同时,较好地保持了其生物学特征,是一种较理想的人成骨细胞培养方法。

改良消化复合植块法培养新生大鼠雪旺细胞

目的探讨改良的单酶消化法与组织贴块法相结合的培养雪旺细胞（SCs）的方法,并与经典植块法和普通消化复合植块法进行比较。方法取新生3～5 d的SD大鼠双侧坐骨神经和臂丛神经,分别采用经典植块法、普通消化复合植块法、改良消化复合植块法培养SCs。培养7 d后进行细胞消化和传代,在显微镜下计数并计算细胞总量。用S-100免疫荧光染色法检测所获细胞的纯度。结果改良消化复合植块法培养的SCs生长增殖速度最快,可获取（1.85±0.13）×10^6个细胞;普通消化复合植块法次之,可获取（1.10±0.10）×10^6个细胞;经典植块法所获SCs的生长增殖速度最慢,可获取（0.77±0.03）×10^6个细胞,3种方法比较差异均有统计学意义（P〈0.01）。S-100免疫荧光染色结果显示,改良消化复合植块法细胞纯度为（95.73±1.51）%,普通消化复合植块法为（84.66±2.68）%,经典植块法为（74.50±4.23）%,3种方法比较差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论改良消化复合植块法可以在短时间内获得大量高纯度的SCs,为研究周围神经修复再生奠定良好的基础。

植块法原代培养人衰老皮肤成纤维细胞

目的:探索和建立人衰老皮肤成纤维细胞的体外培养的方法,为其在医学美容抗衰老研究中的应用提供科学依据。方法:植块法原代培养人衰老皮肤成纤维细胞;倒置显微镜下观察细胞的生长状态;HE染色观察细胞的形态及着色情况。结果:用植块法培养的人衰老皮肤成纤维细胞在显微镜下呈长梭形,有突起,平行、放射状或漩涡状排列。结论:确立了人衰老皮肤成纤维细胞的体外培养的方法,使其可供于延缓皮肤衰老的实验研究。

植块法分离培养人脐带间充质干细胞

目的 探讨体外植块法分离人脐带间充质干细胞的可行性,为体外获取纯度较高的人间充质干细胞提供理论基础。方法 采用植块法分离培养人脐带间充质干细胞,在倒置相差显微镜下观察细胞的黏附、增殖及形态学的变化,并采用CCK-8法绘制P3代细胞生长曲线。结果 脐带组织贴壁培养6~10d即可从组织块边缘爬出的成纤维样细胞,传代后,细胞均呈长梭形,以栅栏样、漩涡样及鱼群样贴壁生长,细胞间紧密排列,细胞生长曲线呈近似S型。结论 植块法能从人脐带组织中简便高效地分离出高纯度、高增殖活性的人脐带间充质干细胞。

运用无胰酶植块法培养大鼠嗅鞘细胞的研究

目的:探讨无胰酶植块法进行大鼠嗅鞘细胞(OECs)培养对OECs形态特征的影响。方法:选用妊娠14d左右的SD雌性大鼠,取出其胎鼠,剥离嗅球,剪碎组织,分别用常规培养法无胰酶植块法分离OECs,用含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基培养嗅鞘细胞,免疫荧光染色检测p75神经生长因子受体(p75 NG-FR)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,同时测量0ECs轴突的长度。结果:无胰酶消化的OECs克隆团处有大量的OECs向外延伸,分离单个OECs发现与常规培养法相比,其神经细胞轴突显著伸长;常规培养法可获取1.04×10^7个细胞,无胰酶植块法可获取3.09×10^7个细胞。结论:无胰酶植块法可获取大量的OECs,且OECs的轴突较长。

改良的酶消化后植块法体外培养雪旺细胞

目的 观察改良的酶（浓度为2g/L的胶原酶）消化后植块法体外培养雪旺细胞（SCs）效果,探讨高效获取高纯度、高活性SCs的培养纯化方法.方法 取新生SD大鼠坐骨神经,剥离神经外膜,剪块,分别采用单酶消化后植块法与双酶消化法进行培养.以活细胞计数和S-100单抗标记相结合判断SCs增殖和纯化程度,比较2种方法的优劣.结果 改良的单酶消化后植块法可获取3.5x106个SCs,成活率为96%,纯度达94%以上：双酶消化法约获取3.0×106个SCs,成活率为92%,纯度达90%.结论 采用改良的酶消化后植块法培养SCs,可较快得到数量多、纯度高的SCs,符合实验要求,值得推广应用.

乳鼠坐骨神经植块法的雪旺氏细胞培养

目的:改善并建立一种新的大鼠雪旺氏细胞(SCs)的培养方法,为研究外周神经损伤修复模型及其它外周神经相关实验提供高纯度、多数量的SCs。方法:麻醉后显微镜下解剖并分离新生3天内SD大鼠的坐骨神经,采取植块培养的方法,显微镜下尽量剥除坐骨神经纤维外膜,并梳理松解坐骨神经的神经纤维束。梳理后剪碎坐骨神经,每小块种植于培养皿中,使用纯血清培养4小时,再加入正常的DMEM/F12培养基,消化培养2-3代。最后用S-100及GFAP免疫荧光染色进行纯度鉴定。结果:本实验在总结前人实验的基础上,联合创新采用坐骨神经外膜剥除、神经内膜梳理、纯血清培养以及胰酶差速消化等方法,短时间内获得SCs的纯度可达99%以上,可用于进一步对雪旺氏细胞的功能进行研究。结论:这种选用乳鼠坐骨神经植块、血清培养的方法简单易操作,无需额外的生长因子及抑制因子,可在短期内获得大量高纯度的SCs。

连续植块培养原代成骨细胞及其特性的比较

目的 :探讨简便、经济、高效的原代成骨细胞培养方法 ,并比较其特性。方法 :收集 1～ 4次连续植块培养获得的SD乳鼠颅盖骨原代成骨细胞 ,观察第 1～ 4次连续植块培养获得的成骨细胞在细胞形态、分裂增殖、碱性磷酸酶 (ALP)活性及骨钙素和BMP 2免疫组织化学表达的变化。结果 :连续植块培养收集的 1～ 4次原代成骨细胞 ,在细胞贴壁、变形、铺展、汇合时间 ,Gomori改良钙 -钴法ALP活性 ,骨钙素及BMP 2免疫组织化学染色表达上 ,均没有明显的区别。结论 :连续植块培养可获得与植块培养性状相同的SD乳鼠原代成骨细胞 ,且细胞数量多 ,节约经费、时间 ,操作简便。

人脐带间充质干细胞分离培养方法的优化

目的:优化人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)分离培养的方法。方法:无菌条件下剔除剖腹产胎儿脐带动静脉,用牙剪子剪为约1mm3但彼此相连的组织块,得到贴壁细胞,采用半量换液进行原代及传代培养。用流式细胞仪检测其免疫表型。结果:成功从人脐带中分离纯化得到UC-MSCs,呈条形和成纤维细胞样的两种形态。UC-MSCs高度表达CD105、CD73、CD44、CD90,极少数表达CD45、CD34、CD14和HLA-DR。结论:建立出一种快捷经济的UC-MSCs体外分离培养方法。

雪旺氏细胞体外培养方法研究

为在短时期内培养大量的雪旺氏细胞，本文对目前常用的两种培养方法进行了比较。方法：采用植块反复种植法和酶消化法分别进行雪旺氏细胞的体外培养。结果表明两种方法都能得到雪旺氏细胞。但酶消化法所培养的雪旺氏细胞生长一致，相同条件下达到一定细胞数量所需时间短于植块反复种植法。酶消化法比植块反复种植法更适用于大量雪旺氏细胞的培养。

大鼠胚胎干细胞饲养层制作方法的改进

目的采用两种方法制备饲养层细胞,对比观察培养效果,求得最佳培养方法,以期实现其有效利用。方法取大鼠胚胎分离成纤维细胞,分别采用细胞悬液法和胰酶消化植块培养法对其进行培养。在生长细胞形态,活细胞百分率等方面对两种方法进行比较。结果胰酶消化植块培养法在细胞获得量、细胞活力和贴壁细胞的形态上均优于常规的细胞悬液法,且操作简单,速度快。结论胰酶消化植块培养法是一种能够获得高成活率、高收获量、细胞形态和生长状况良好的体细胞培养方法。

人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性

背景:由于大量获取骨髓细胞存在困难,并且骨髓间充质干细胞随年龄的增加出现数量及分化潜能下降,因此需要寻找其他间充质干细胞来源。目的:优化人脐带间充质干细胞的分离培养条件,进一步明确其生物学特性。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-09/2008-03在中国医学科学院血液学研究所国家重点实验室完成。材料:17份脐带标本取自健康足月新生儿,由天津市中心妇产医院提供。方法:脐带采集后在6h内分别用植块法、胶原酶消化法、胶原酶与胰酶联合消化法进行分离培养,于培养第14天计数集落数,超过50个细胞计为集落。当细胞达70%～80%融合时,胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合消化,以(2.5～5.0)×103/cm2密度传代培养。主要观察指标:比较不同培养方法所获贴壁细胞的形态学特征、细胞产率,应用流式细胞技术分析细胞增殖活性、免疫表型,特异性染色方法鉴定细胞的多向分化潜能。结果:植块法培养6～10d可见成纤维样细胞从植块边缘爬出,形态与骨髓间充质干细胞相似,散在分布或形成小克隆,原代可获得(5.2±1.7)×105个贴壁细胞/0.5cm脐带组织,至少可稳定传15代,平均每代扩增6.2倍,在原代细胞克隆数、细胞产率、传代时间及扩增倍数上与胶原酶消化法比较存在明显差异(P<0.05);而胶原酶与胰酶联合消化法接种后未见明显贴壁细胞。人脐带间充质干细胞的倍增时间为45h,72.09%细胞处于G0/G1期,不表达造血细胞及内皮细胞标记,高表达整合素和黏附分子CD44,CD90,CD95以及CD73,CD105,在特定诱导条件下,人脐带间充质干细胞能够向成骨及成脂肪细胞方向分化。结论:应用植块法可以从人脐带组织中简便高效地分离出一群具有高增殖活性及多向分化潜能的间充质干细胞,其免疫表型类似于骨髓间充质干细胞。

大鼠缺血心肌微血管内皮细胞的培养和鉴定

目的 建立大鼠缺血心肌微血管内皮细胞（Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs）培养模型,为进一步研究其生物学特征提供实验基础.方法选取220~280 g成年雄性SD大鼠,结扎法建立心肌缺血模型,植块法培养结扎后24 h、3 d、7 d的心肌缺血模型大鼠CMECs,倒置相差显微镜观察培养细胞的形态学特征,观察不同时间点缺血模型CMECs生长状况,免疫细胞化学方法显示CMECs特异性抗原.结果 镜下观察部分CMECs刚游离出组织块时呈星形或多边形,当细胞生长至亚融合状态呈短梭形并呈铺路石样,部分区域可见管腔样或血管网络状结构,具备典型微血管内皮细胞特征;心肌缺血7 d时,缺血心肌组织CMECs密度最大;免疫细胞化学染色鉴定,Ⅷ因子、CD31相关抗原均为阳性,阳性率分别为（95.1±1.2）%、（95.0±1.6）%.结论 本方法可获得纯度高、结构和功能良好的缺血CMECs,为缺血性心血管疾病研究奠定基础.

小鼠胰星状细胞的分离培养及鉴定

目的:建立简单易行的小鼠胰星状细胞(PSCs)原代培养方法,为胰腺纤维化研究提供可靠的体外细胞模型.方法:采用植块法结合酶消化法进行培养,即在无菌条件下取小鼠正常胰腺组织,经过剪碎、胰蛋白酶消化后植入培养瓶中贴壁培养,并予限制性条件培养基进行纯化,通过倒置生物显微镜对传代前后所培养细胞进行形态学、自发荧光及油红染色脂滴的观察,并结合细胞免疫化学和免疫荧光等方法来鉴定小鼠PSCs.结果:小鼠原代PSCs培养3-4d后油红染色阳性,并能观察到自发荧光现象;传代后的细胞形态主要表现为体积较大,伪足发达,呈"星芒状"或"乌贼样";细胞免疫荧光染色和细胞免疫化学染色显示α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达阳性.结论:植块与酶消化结合法分离小鼠胰腺星状细胞,简单实用、成功率高,能够满足体外实验的要求.