肠道植物乳杆菌细胞外囊泡对酒精依赖大鼠酒精偏好调控作用

目的 研究植物乳杆菌来源的细胞外囊泡(L-EVs)对酒精依赖大鼠酒精偏好的影响,为酒精依赖的临床治疗及预防提供理论依据。方法 SD雄性大鼠(180~200g)利用慢性间歇性主动饮酒(IA2BC)方法建立大鼠酒精依赖模型。当建模21d时,随机将饮酒大鼠分为腹腔注射组和中脑腹侧背盖区(VTA)注射组,VTA注射组给予脑立体定位术在VTA留置套管,继续完成28d建模;建模成功后测量大鼠戒断0h、72h后再饮酒时酒精偏好。在酒精戒断期间向大鼠腹腔或者直接VTA注射L-EVs,测量给药后大鼠的酒精偏好,部分大鼠预先在VTA注射原肌球蛋白受体激酶B(TrkB)的拮抗剂K252a。结果 腹腔注射L-EVs后,与戒断组和溶剂组相比,SD大鼠的酒精偏好明显降低(P<0.01),VTA中微量注射L-EVs后,与假手术组和溶剂组相比,SD大鼠酒精偏好均明显降低(P<0.01),而在L-EVs注射前预先注射K252a可以拮抗L-EVs对酒精依赖大鼠酒精偏好的抑制作用。注射L-EVs与向VTA注射脑源性神经营养因子(BDNF)对酒精依赖大鼠戒断后再饮酒时饮酒偏好的影响是相似的。并且,腹腔注射L-EVs可以增加酒精依赖大鼠VTA BDNF的表达。结论 植物乳杆菌来源的EVs可能通过BDNF发挥对酒精依赖大鼠的酒精偏好调节作用。

细胞外囊泡在幽门螺杆菌感染中的研究进展

细胞外囊泡(EV)是参与细胞间相互作用的重要信息物质,大多数细胞均可分泌EV,在感染过程中,EV可在宿主与病原体间行使交互作用,可携带生物信号分子,实现细胞间通讯。受病原体感染的宿主细胞能释放EV,影响机体微环境,调节炎症免疫反应,参与细胞迁移、细胞生长、细胞分化和血管新生等过程。幽门螺杆菌(Hp)感染被认为是导致胃癌发生发展的主要危险因素,Hp感染的宿主细胞与Hp源性EV的相互作用可能参与胃癌的发生发展。该文简要综述Hp感染的宿主细胞与Hp源性EV的相互作用与胃癌的发生发展的关系,以提供Hp感染相关胃癌的预防策略。

基于SKP-SCs来源的胞外囊泡构建的组织工程神经移植物的生物安全性评价

目的:评价基于皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)分化成的施万细胞(Schwann cells,SCs)来源的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)构建的组织工程神经移植物(tissue engineered nerve graft,TENG)的生物安全性。方法:将SKP-SCs来源的EVs(SKP-SC-EVs)注射至带有3根纤维支架的壳聚糖导管中制备成TENGs,修复比格犬坐骨神经40 mm缺损。术后6个月,取心、肝、脾、肺、肾、脑,通过HE染色进行形态学观察,并收集血液进行血液常规和生化指标分析,包括:白细胞、中性粒细胞、红细胞、血小板、总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶和血糖等。结果:形态学分析显示TENGs组比格犬的各脏器组织结构清晰,与自体移植组、壳聚糖导管组相比,各项血液指标差异均无统计学意义(均P>0.05),且未见毒性反应改变。结论:基于SKP-SC-EVs构建的TENGs植入比格犬体内具有良好的生物安全性,为临床应用TENGs治疗周围神经损伤提供安全性数据支持。

植物乳杆菌胞外多糖对小鼠树突状细胞分泌的调控

采用细胞因子诱导法,以加入重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)及10%胎牛血清的RPMI1640为完全培养基培养树突状细胞(DCs)。实验组加入植物乳杆菌胞外多糖,脂多糖LPS和RPMI1640分别作为阳性和空白对照。采用Griess法和双抗体夹心ELISA检测DCs分泌NO,促炎症因子IL-12p70,抗炎症因子IL-10和趋化因子RANTES的浓度。结果表明:植物乳杆菌胞外多糖刺激DCs后,DCs分泌NO、IL-12p70、IL-10和RANTES的浓度分别是空白组的110%、194%、76%和133%,且呈剂量依赖关系。植物乳杆菌胞外多糖能促进小鼠骨髓来源的DCs分泌能力。

大肠杆菌胞外囊泡对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的研究大肠杆菌胞外囊泡(E.coli-OMVs)对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法采用差速离心法提取大肠杆菌胞外囊泡,观察囊泡形态并测定囊泡粒径范围。随机分为4组:正常对照组、胞外囊泡低剂量组(100μg/m L E.coli-OMVs)、胞外囊泡中剂量组(500μg/m L E.coli-OMVs)和胞外囊泡高剂量组(1000μg/m L E.coli-OMVs)。MTT检测各组细胞增殖能力;TUNEL和Western blot分别检测各组细胞凋亡情况及凋亡相关蛋白caspase3的表达;Transwell检测各组细胞迁移能力。结果透射电镜下E.coli-OMVs呈双层膜、中空、圆形或椭圆形,其内含低密度或高密度物质,具有明显的异质性,粒径分析结果表明其直径分布在30~450 nm。与对照组相比,经E.coli-OMVs干预后,SK-N-SH细胞增殖能力显著降低;细胞凋亡增加,caspase3蛋白表达水平明显上调;而迁移能力显著降低(P<0.05)。结论 E.coli-OMVs对SK-N-SH细胞具有直接杀伤作用,有望成为难治性神经母细胞瘤的治疗药物。

枯草芽孢杆菌胞外囊泡的分离及其对巨噬细胞免疫功能的影响

益生菌产生的细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)具有介导细菌-宿主间的相互交流、呈递细菌抗原和调节宿主免疫功能等作用。为了研究枯草芽孢杆菌(B.subtilis)来源的胞外囊泡(BS_EVs)对巨噬细胞免疫应答反应的影响,该试验通过超速离心和密度梯度离心法分离纯化了枯草芽孢杆菌来源的BS_EVs,并分别用6组不同浓度的BS_EVs和PBS(对照组)刺激小鼠巨噬细胞12 h。试验结束后,收集细胞培养上清液和细胞裂解液,测定细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性和细胞因子分泌量、细胞裂解液中免疫相关酶活性。结果显示:(1)采用差速离心和梯度密度离心法成功从B.subtilis 168培养上清中获得纯化的BS_EVs;(2)在细胞试验中,低浓度处理组(1、2和4μg/mL BS_EVs)对细胞活性无显著影响(P>0.05),而高浓度处理组(8和16μg/mL BS_EVs)则显著降低了细胞活性(P<0.05);各处理组对免疫反应相关酶活和炎性细胞因子分泌量均有显著影响(P<0.05),其中高浓度处理组表现出更强烈的促炎作用。研究结果表明,适量BS_EVs可增强巨噬细胞免疫功能,揭示了肠道微生物与宿主相互作用的可能通路。

乳杆菌源性外囊泡对LPS诱导小胶质细胞活化的影响及蛋白质组学分析

目的评价乳杆菌源性细胞外囊泡(Lac-EVs)对脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞活化的影响及蛋白质组学分析。方法取生长状态较好的小鼠BV2小胶质细胞,采用随机数字表法分为3组(n=12):对照组(C组)、LPS组(L组)和LPS+Lac-EVs组(L+E组)。C组正常培养;L组LPS(终浓度1 μg/ml)孵育24 h;L+E组于LPS处理后24 h加入Lac-EVs(终浓度2.5 μg/ml)孵育24 h。随后采用免疫荧光染色法检测CD86和CD206的表达。取L组和L+E组细胞沉淀,采用蛋白质组学方法筛选两组差异表达蛋白。对鉴定得到的差异表达蛋白进行生物信息学分析并采用RT-qPCR和Western blot法对载脂蛋白1(Apoa1)和G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2(Git2)两个差异表达蛋白进行验证。结果与C组相比,L组CD86表达上调,CD206表达下调(P<0.05);与L组相比,L+E组CD86表达下调,CD206表达上调(P<0.05)。采用蛋白质组学法筛选出125个差异表达蛋白(FC=2.0,P<0.05),其中66个蛋白表达上调,59个蛋白表达下调,其中Apoa1和Git2表达上调并且排名较前。GO分析结果表明,这些差异表达蛋白主要参与内皮细胞增殖、SDNA损伤检查以及脂蛋白运输等生物过程。KEGG分析结果表明,PPAR信号通路、内吞作用、代谢途径、MAPK信号通路等存在差异。Western blot法和RT-qPCR法测定上述差异蛋白的表达趋势与蛋白质组学结果一致。结论 Lac-EVs可抑制LPS诱导小胶质细胞向M1型极化,其机制可能与上调的差异表达蛋白Apoa1和Git2有关。

细胞外囊泡在肝移植中的应用进展

肝移植是治疗终末期肝病的有效方法,而肝缺血-再灌注损伤(IRI)和排斥反应大大降低了移植肝的存活率。因此,急需一种既可以减轻肝IRI又可以促进同种异体移植物免疫耐受的新方法,以提高移植肝的存活率。细胞外囊泡(EV)是由细胞释放到细胞外微环境的纳米颗粒,可以通过修复自噬、免疫抑制和促进组织再生减轻移植物损伤。这使得EV成为肝移植领域的研究热点,但其临床应用面临着众多挑战,如EV的分离、纯化、鉴定、储存以及如何靶向递送到目标细胞等。本文对EV在肝IRI中的作用机制、EV临床应用面临的挑战及EV的潜在应用进行综述,旨在为EV在肝移植的临床应用提供参考。

血浆胎盘源性细胞外囊泡异常增高预警重度子痫前期患者不良妊娠结局

目的:评价血浆中胎盘源性细胞外囊泡(pcEV)及其清除蛋白乳凝集素(Lactadherin)预测重度子痫前期(sPE)患者妊娠不良结局的诊断性能。方法:回顾性病例对照研究。收集2018年1月31日至2019年1月31日产检并分娩妊娠27~37周诊断为sPE的患者60例,年龄32(29,36)岁,根据发生终点事件(胎儿窘迫和/或胎儿生长受限)情况,将sPE患者进一步分为事件组34例,无事件组26例。同孕周健康孕妇33例为孕妇对照组,年龄31(29,36)岁。非孕期健康女性25例为健康对照组,年龄26(25,38)岁。采用流式细胞仪检测胎盘碱性磷酸酶抗体阳性者为pcEV,同时膜表面表达磷脂酰丝氨酸者,即膜联蛋白V(AV)阳性为AV+pcEV。ELISA法检测Lactadherin水平。用Logistic回归做多元相关性分析,用受试者工作特征(ROC)曲线评价pcEV和Lactadherin预测妊娠不良结局的性能。用Kaplan-Meier曲线进行生存分析。用Cox比例风险回归模型计算风险比(HR)。结果:sPE组血浆AV+pcEV水平为8260(4991,16751)个/μl,高于健康孕妇组的1088(784,1871)个/μl和健康对照组的206(116,256)个/μl(H=94.490,P<0.05)。事件组sPE患者血浆AV+pcEV水平为11225(7496,20599)个/μl,高于无事件组的5199(2914,8347)个/μl(U=178,P<0.05)。sPE组血浆Lactadherin为2635(1876,3137)pg/ml,高于健康孕妇组的1597(1287,1818)pg/ml和健康对照组的1123(749,1405)pg/ml(H=54.307,P<0.05)。ROC曲线显示,AV+pcEV预测sPE患者77 d内发生胎儿窘迫和/或胎儿生长受限事件的临界值为6524个/μl时,曲线下面积(AUC)为0.799(95%CI 0.680~0.917)。Lactadherin预测的临界值为2336.5 pg/ml时,AUC为0.702(95%CI 0.564~0.841)。Logistic回归分析显示,sPE患者AV+pcEV水平与患者24 h尿蛋白定量(OR=9.288,95%CI 1.993~43.293)以及患者是否需要联合用药降压治疗(OR=18.690,95%CI 1.919~182.077)有相关性(P<0.05)。生存分析显示AV+pcEV水平高于临界值的sPE患者在77 d内的发生胎儿窘迫和/或胎儿生长受限事件的累积概率增高(Log-rankχ^(2)=21.430,P<0.05)。Cox比例回归模型显示AV+pcEV水平可独立识别胎儿窘迫和/或胎儿生长受限事件(HR=7.983,P<0.05)。结论:妊娠晚期孕妇血浆中pcEV水平变化与PE病情发展相关,高浓度pcEV提示胎儿窘迫、胎儿生长受限风险增加,可作为预警不良妊娠结局的有效标志物。

药用植物细胞外囊泡作为新型药效物质的研究进展

药用植物细胞外囊泡(medicinal plant-derived extracellular vesicles,MPEVs)是由其药用植物特定部位细胞分泌的,装载有小分子化合物、核酸、蛋白质和脂质等功能物质的纳米级膜囊泡。由于具有其同源植物中的活性物质,MPEVs具有特殊的生物活性。通过对近年来MPEVs的分离纯化、鉴定、成分分析、生物活性等方面进行总结分析,为作为新型药效物质的深入研究提供借鉴和启示。

植物外泌体的研究进展

植物外泌体是由植物细胞分泌的纳米级小囊泡,内含DNA、小RNA(small RNA,sRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)和蛋白质等物质,介导细胞间的通讯。其中miRNA是高效的基因表达调控因子,可进行跨界基因表达调控;sRNA通过胞间连丝在宿主和生物之间转移并诱导基因沉默。植物外泌体通过所含物质发挥抗炎、抗病毒、抗纤维化、抗肿瘤等作用,参与病原体侵袭的防御反应。植物外泌体纳米粒大多可食用,可作为递送特定药物的载体,无毒性及副作用,因此已成为研究热点之一。本文整理了近年植物外泌体研究相关的文献报道进展,对药用植物外泌体的来源和作用进行了总结和分析,以期为将来植物外泌体的研究提供新的思路与方法。

不同来源细胞外囊泡在中药组分高效递送领域中应用的研究进展

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是内源性脂质双分子层纳米囊泡,由内溶酶体途径主动合成并分泌到细胞间隙或系统循环中,具有高生物相容性、低免疫原性及靶向性等特点。EVs不仅在细胞间通讯发挥重要作用,由于其复杂的组成及在健康和疾病中的作用,其作为治疗手段也越来越受到重视。中药活性成分具有明确的药理作用,然而其溶解度差、生物利用度低、存在不良反应等缺陷限制了其临床应用,利用EVs作为载体递送中药组分可提高其生物利用度等。通过对不同来源EVs的分泌、生物学功能、载药方式及其在多种疾病的药物递送及治疗中的重要应用进行综述,为EVs递送中药组分在临床中的应用提供依据。

植物乳杆菌JLK0142胞外多糖对RAW264.7巨噬细胞和免疫抑制小鼠的免疫调节作用

【目的】研究植物乳杆菌JLK0142胞外多糖(EPS)对RAW264.7巨噬细胞和免疫抑制小鼠免疫活性的影响。【方法】从植物乳杆菌JLK0142培养液中分离纯化EPS,采用体外细胞培养,测定EPS对巨噬细胞增殖、吞噬活性和一氧化氮(NO)分泌的影响;采用环磷酰胺构建免疫抑制小鼠模型,灌胃不同剂量的EPS,分别测定小鼠脾脏指数、T淋巴细胞增殖活力及血清中IL-2和TNF-α水平。【结果】植物乳杆菌JLK0142胞外多糖在50–800μg/m L浓度范围内能促进正常状态RAW264.7巨噬细胞的增殖,显著提高巨噬细胞的吞噬活性及NO的分泌量;与模型组相比,EPS中、高剂量组小鼠脾脏指数和T淋巴细胞增殖活力显著提高;EPS高剂量组小鼠血清中IL-2和TNF-α含量显著提高。【结论】植物乳杆菌JLK0142胞外多糖能有效提高RAW264.7巨噬细胞的免疫活力,并拮抗环磷酰胺对小鼠免疫功能的抑制作用。

早产儿和足月儿母亲母乳来源外泌体的蛋白质组学差异分析

目的分析早产和足月儿母乳来源外泌体(breast milk extracellular vesicles, BM-EV)的蛋白质组学差异。方法收集2019年在南京医科大学附属妇产医院出生的早产儿和足月儿母乳各3例, 采用超速离心法提取外泌体。初步鉴定外泌体特征后, 采用液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)定量分析, 筛选出早产儿BM-EV中显著上调的差异蛋白质(差异倍数≥1.5且P<0.05), 并进行GO和KEGG功能预测及相关信号通路分析。采用Mann-WhitneyU检验或Fisher精确概率法进行组间比较。以Pearson相关分析描述样品间蛋白质定量值的相关性。使用t检验比较2组样本间蛋白质丰度的差异, 并对结果进行多重校正。应用超几何分布检验, 筛选出差异蛋白质中显著富集的GO和KEGG通路条目。结果 (1)早产和足月组初产母亲分别为3例和1例。足月儿和早产儿BM-EV存在标记性蛋白分子分化簇9、分化簇81和热休克蛋白70。(2)6个样本组间可比性较好, 组内重复性较高, 样品间蛋白定量值的相关性最高达0.99。早产和足月儿样本的变异系数分别为11.21%和19.72%, 且早产样本的变异系数比较集中。(3)鉴定得到945种蛋白质。早产与足月儿BM-EV之间存在156种差异蛋白质, 其中在早产儿BM-EV中有83种上调。早产儿BM-EV中丰度值前3位的蛋白质分别为补体C4a、脂肪酸合成酶和硬化蛋白结构域蛋白-1。(4)GO功能预测中富集度最高的生物过程或细胞成分主要集中在血红蛋白和糖原的合成, 参与免疫突触的构成, Fc γ受体信号通路介导的吞噬作用等。KEGG信号通路相关性最高的通路为核糖体相关通路、补体和凝血级联、中性粒细胞胞外陷阱形成和Fc γ受体介导的吞噬作用等。结论早产儿BM-EV中显著上调的差异蛋白质可能通过参与调节早产儿的免疫、胃肠道功能和能量代谢过程, 从而发挥保护作用。

植物来源囊泡及其生物医学应用研究进展

植物细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是一种由植物细胞分泌的,以脂质双层为基本骨架、包裹各种蛋白和核酸等活性物质的膜性小泡,对植物的生长发育、组织修复和自体防御等过程起重要作用。近年来,参照EVs的分离方法,从植物样本中制备得到细胞外囊泡样纳米粒(extracellular vesicle-like nanoparticles,EVNs)具有与EVs相似的结构组成,也显示出独特的活性功能。本文将上述结构统称为植物来源囊泡(plant-derived vesicles,PDVs),系统介绍了PDVs生源途径、分离表征方法和体内外性质,讨论其作为天然治疗剂和药物功能载体等方面的生物医学应用,最后对该领域存在的问题及未来发展方向提出观点和建议。

Mtb-EVs的提取及其对鼠源树突状细胞ROS和炎症因子表达的影响

目的提取结核分枝杆菌(M.tuberculosis,Mtb)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs),检测其形态、粒径大小及分布,研究Mtb-EVs对树突状细胞(dendritic cell,DC)胞内活性氧(ROS)和细胞因子水平的影响,初步探讨其对DC的免疫调节作用。方法超滤浓缩法分离获取Mtb-EVs,BCA法检测蛋白浓度,负染电镜检测Mtb-EVs形态,纳米颗粒跟踪分析技术检测其粒径大小分布和浓度;无菌分离获取小鼠骨髓,经重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rm GM-CSF)和重组小鼠白细胞介素-4(rm IL-4)联合诱导扩增出DC,并进行形态学及免疫表型鉴定;用不同剂量Mtb-EVs作用于DC,DCFH-DA荧光探针法检测DC胞内ROS水平,ELISA法检测DC细胞IL-1β和IL-6分泌。结果超滤浓缩法提取的Mtb-EVs为大小不等的球状囊泡结构,形态典型,直径约100 nm;NanoSight纳米颗粒追踪仪检测结果显示,粒径峰值98.5 nm,平均粒径110.2 nm,主要分布在68.4~155.7 nm之间,小于250 nm囊泡数量占总量98.39%;体外定向诱导扩增的细胞具有典型DC的形态特征,纯度可达85%以上,透射电镜可见DC表面有丰富微绒毛及放射状突起,胞浆均匀,核膜清晰;10^(2)、10^(3)、10^(4)particles/cell Mtb-EVs处理DC后,ROS水平与Mtb-EVs剂量呈正相关(r=0.9694,P<0.05),并以剂量依赖方式诱导细胞释放产生IL-1β和IL-6(P<0.05)。结论本研究建立了超滤浓缩法分离提取Mtb-EVs的技术流程,可得到形态完整、纯度较高、粒径分布集中的细胞外囊泡。同时,Mtb-EVs可以诱发DC胞内ROS水平上调,并以剂量依赖方式诱导细胞因子IL-1β和IL-6的释放。