用于植物基因表达载体构建的质粒改造及其应用

为克服目前常用于植物基因表达载体构建的质粒所具有的酶切位点有限,目的基因片段难于插入和连接,缺少植物基因表达所必须的启动子、终止子、筛选标记等功能元件的缺点,本研究构建了一个用于植物基因表达载体构建的质粒载体pNULPGE200。该质粒载体引入了植物基因表达最常用的CaMV 35S启动子(cauliflower mosaic virus 35S promoter)和NOS终止子(nopaline synthase terminator),以及之间的多克隆酶切位点MCS(multiple cloning site)。利用pNULPGE200构建植物基因表达载体,经PCR等方法克隆得到的目的基因可以直接连接到35S启动子与NOS终止子之间,使目的基因能够在植物体内稳定表达;同时该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素NPT Ⅱ(neomycin phosphotransferase Ⅱ)耐性基因和sGFP(synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation)绿色荧光蛋白报告基因,可用于基因转化时的筛选。本研究以假单胞菌(Pseudomonas putida)携带质粒的二甲苯单加氧酶(xylene monooxygenase)编码基因为材料,分别利用本文质粒载体和常规的质粒载体pBI121构建了植物表达载体,验证了文中质粒载体的实用性。

双价抗病基因植物表达载体构建及在烟草中表达的初步研究

多基因转化是基因工程研究热点之一。本研究应用DNA重组技术,将两个抗病机制不同,抗菌谱较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和兔防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBin35SGAFP-NP1上,两者具有各自的CaMV35S启动子和Nos终止子。通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR和PCR-Southern分析证明已将NP1和GAFP基因整合到烟草基因组中。离体抑菌实验表明转基因植株对真菌和细菌表现出一定的抗性。以上结果表明通过该表达载体进行遗传转化可获得含双价抗病基因植物,并能有效表达,提高转基因植物抗病能力。

OsI2基因的克隆及其植物表达载体的构建

在旱稻IRAT109干旱胁迫下cDNA芯片分析结果的基础上,通过RT-PCR,5'-RACE及3'-RACE方法,从IRAT109总RNA中扩增得到了干旱胁迫下芯片表达谱中上升表达强度第二的基因全长序列,命名为OsI2,全长有523bp,并对基因序列结构进行了分析。该基因与全长cDNA文库中的CT836140.1有99%同源。OsI2基因编码产物对应1个包含57个氨基酸的开放阅读框(ORF),为一功能未知蛋白。其编码产物也可能对应两个中间相隔19bp的较小ORFs(43个氨基酸和42个氨基酸),都是功能未知的蛋白。在pBI121载体的基础上,将OsI2基因与CaMV35S连接成功构建了pBI121-OsI2植物表达载体,为进一步研究其功能创造了条件。

双价抗菌肽基因表达载体的构建

将人工合成的抗菌肽Ｄ基因和抗菌肽Ｂ基因克隆到同一植物表达载体ｐＢⅠ１２１，且各自具有其３５ｓ启动子和Ｎｏｓ终止子。先将抗菌肽Ｄ基因及其启动子和终止子克隆到ｐＢ１２１ＨｉｎｄⅢ位点获得ｐＥＣＶⅠ重组子。然后将抗菌肽Ｂ基因克隆到ｐＥＣＶⅠ的ＢａｍＨⅠ位点，经Ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ检测和酶切鉴定获得具有抗菌肽Ｄ，抗菌肽Ｂ基因的双价基因表达载体ｐＥＣＶⅡ。

Cs-ACS1基因克隆与转化黄瓜研究

采用PCR方法,从全雌系黄瓜基因组DNA中扩增出2333bp的基因片段,BLAST分析结果表明:所克隆的基因序列与Cs-ACS1仅有1个碱基的差异,与Cs-ACS1G的核苷酸序列同源性为98%,而推导氨基酸完全一致;结果表明所克隆的基因为Cs-ACS1基因.构建了该基因的正义表达载体,并导入黄瓜,获得2株转基因植株.