武汉禾元顺利完成植物源重组人血清白蛋白临床前研究

从事分子医药技术研究与产品开发的武汉禾元生物科技有限公司研究组从稻米中提取了重组人血清白蛋白，并于2014年7月7日通过临床前试验，完成了迈向人体药用的关键一步。 北京昭衍新药研究中心和中国人民解放军军事医学科学院依据国家食品药品监督管理总局2007年颁布的局令第28号《药品注册管理办法》规定，完成了植物源重组人血清白蛋白的临床前安全性评价研究。

不同来源的人血清白蛋白对1-磷酸鞘氨醇的结合运载作用研究

目的研究不同来源的人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)对1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)的结合运载作用。方法以人血浆来源HSA(plasma derived HSA,pHSA)和基因重组HSA(recombinant HSA,rHSA)样本为研究对象,首先利用LC-MS/MS技术,比较分析上述样本中S1P含量的差异;其次,在生理浓度条件下,向HSA样本中直接添加S1P进行负载处理,比较不同来源的HSA对S1P结合作用;在无血清培养条件下,将不同来源HSA样本与HUVEC细胞进行共培养,分析不同处理组的细胞培养上清中S1P含量的变化,比较不同来源的HSA对细胞中S1P的运载作用。利用表面等离子体共振SPR技术分析不同来源HSA与S1P分子的相互作用情况并计算其亲和力大小。利用AutoDock Vina软件和Molprophet平台,对HSA和S1P进行分子对接分析,并预测HSA中S1P的关键结合口袋域。结果S1P含量检测结果显示,所有pHSA样本中均含有一定水平的S1P(3.31±0.03~30.35±0.07)μg/L,且不同厂家生产的pHSA样本中的S1P含量差异显著(P<0.001);然而所有rHSA样本中均未检测出S1P。负载处理结果显示,不同来源HSA对S1P的结合作用存在显著差异(P<0.001),且rHSA对S1P平均负载量约为pHSA的2倍(ΔC_(rHSA)=801.75±142.45μg/L vsΔC_(pHSA)=461.94±85.73μg/L;P<0.001,t=5.006)。共培养处理结果显示,所有HSA样本处理组与HUVEC细胞共培养处理6h后上清中的S1P浓度均明显升高,而空白对照组上清中S1P浓度无变化;处理6 h、12 h和24 h后各处理组间上清中S1P浓度均存在显著差异(P<0.001)。SPR分析结果显示,与rHSA相比,pHSA与S1P之间的亲和力更高(KD_(pHSA-S1P):2.38E-06,KD_(rHSA-S1P):3.72E-06)。分子对接分析和结合口袋预测发现,HSA与S1P的关键结合口袋可能位于HSA分子的IB亚结构域。结论不同来源的HSA对S1P均具有一定的结合运载作用,但这种作用差异具有统计学意义,与HSA分子的IB亚结构域存在关联。

利用血清筛选和模拟胃肠液消化稳定性试验评价植物源重组人血清白蛋白潜在致敏性

目的利用血清筛选试验和模拟胃肠液消化稳定性试验,探讨植物源重组人血清白蛋白(OsrHSA)是否具有潜在致敏性。方法选择对虾、小麦、屋尘螨、鸡蛋、牛奶过敏,特异性IgE抗体浓度大于3.5 kUA/L的患者血清75份和健康人血清4份,利用酶联免疫吸附试验探讨OsrHSA能否与过敏血清中的过敏原特异性IgE抗体结合;按照国家标准《转基因生物及其产品食用安全检测模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法》进行OsrHSA的模拟胃肠液消化稳定性试验,评估OsrHSA的消化稳定性。结果有3份对牛奶过敏的血清与OsrHSA发生免疫交叉反应,该蛋白与牛奶过敏原可能存在抗原交叉性;OsrHSA在模拟胃肠液中15 s内即被消化完全,表明该蛋白极易被消化。结论OsrHSA的潜在致敏性较低,对牛奶过敏的人群需要慎重使用。

植物源无血清培养基的研究进展

在培养基中添加血清是目前培养哺乳动物细胞最常见的方法,血清几乎可以提供细胞生长的一切营养物质,但同时,血清成分复杂,价格昂贵,会增大变异和宿主动物病原体感染的风险,导致细胞污染。而在培养基中添加植物源蛋白水解物代替血清,不仅能避免它带来的外源性污染缺陷,还能获得良好的细胞培养效果并维持其原有生物学功能,大大提高生物安全性,降低细胞培养成本。综述了植物源无血清培养基的研究现状,阐述了现有研究的问题和未来研究的潜在方向,为后续植物源无血清培养基的开发提供理论指导。

五种植物蛋白源替代鱼粉对花鲈血清生化指标、转氨酶活性及抗氧化应激参数的影响

选用480尾体重为(9.69±0.15)g的花鲈(Lateolabrax japonicus)随机分成6组,分别投喂含40%鱼粉的基础饲料(鱼粉组)和用23.30%豆粕、22.40%花生粕、23.82%棉粕、27.77%菜子粕、38.98%玉米DDGS蛋白替代16%鱼粉的5种替代饲料(替代组),饲养28 d后测定血清生化指标、转氨酶活性和抗氧化应激参数。结果表明,各替代组血清中血糖(GLU)、尿素氮(UN)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与鱼粉组相比差异不显著(P>0.05)。DDGS组血清总蛋白(TP)含量显著低于鱼粉组(P<0.05),血清胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)含量显著高于豆粕、花生粕、棉粕和菜子粕组(P<0.05)。与鱼粉组相比,各替代组血清谷草转氨酶(AST)活性无显著性差异(P>0.05),花生粕、棉粕、菜子粕和DDGS组血清谷丙转氨酶(ALT)活性显著降低(P<0.05)。各组血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)无显著性差异(P>0.05),菜子粕和DDGS组血清过氧化氢酶(CAT)活性显著低于鱼粉组(P<0.05),菜子粕组血清羟自由基和丙二醛(MDA)含量显著高于鱼粉组(P<0.05)。当蛋白替代16%鱼粉时,豆粕对花鲈血清生化指标、转氨酶活性及抗氧化参数的影响最小,是替代鱼粉的适宜植物蛋白源。

基于种子生产植物源重组药物蛋白研究进展

种子作为植物重要储藏器官之一,为高效表达外源重组药物蛋白提供了理想的载体。与其他植物生产系统相比,植物种子反应器具有多方面的优势,如表达水平较高,重组蛋白活性稳定,易于储藏和运输以及便于加工、分离和纯化等。在过去的20年中,利用植物种子作为反应器表达了一系列重组药物蛋白,部分药物蛋白已进入商业化生产阶段。本文对种子生物反应器的特点及利用,就近年来基于种子生产植物源重组药物蛋白的研究进展进行了综述,并对植物种子生物反应器研究中的几个问题及未来的发展方向进行了探讨。

重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中分泌表达影响因素的研究

为获得高产稳产重组人血清白蛋白的Pichiapastoris细胞株用于高密度发酵 ,构建了多种分泌表达载体 ,在Pichiapastoris中作表达 ,研究表达载体构建等因素对表达量的影响。发现采用酿酒酵母α性成熟因子前导肽比人血清白蛋白天然前导肽作为分泌信号肽的表达量要高 10 %左右。而载体整合方式、整合拷贝数、5’非翻译区的改造和甲醇利用表型等对表达量无规律性影响。筛选到的高表达株经高密度发酵 ,细胞湿重达 46 0 g/L ,发酵液上清的人血清白蛋白含量为 1 0 g/L。

重组人血清白蛋白发酵过程生长期的代谢计算

结合元素平衡和代谢平衡 ,建立了重组人血清白蛋白发酵过程生长期的数学模型 ,并按单纯形多变量最优化方法估算了模型的未知参数。该模型能较好地描述重组人血清白蛋白发酵过程生长期中各宏观反应速率之间的关系 ,为重组人血清白蛋白宿主菌—Pichiapastoris的高密度培养提供了依据。

糖化血清白蛋白、空腹血糖、糖化血红蛋白在肝源性糖尿病中的意义

目的比较肝源性糖尿病患者与肝炎肝硬化患者血清中的糖化血清白蛋白(glycosylated serum,GA)、空腹血糖(fastingblood glucose,FBG)、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)浓度,评价其在监测肝源性糖尿病糖代谢过程中的意义。方法以27例肝源性糖尿病及54例肝炎肝硬化患者为研究对象,取入院患者次日晨起空腹血清分别检测GA、FBG、HbA1c。结果①肝源性糖尿病组GA值、HbA1c值均明显高于对照组,2组差异有统计学意义(P<0.01)。②肝源性糖尿病组,FBG大于7.0mmol/L者占66.7%(18/27);HbA1c大于6.5%者占22.2%(6/27);GA高于16.87%者占92.6%(25/27)。肝硬化组FBG大于7.0 mmol/L者占3.7%(2/54);HbA1c大于6.5%者占1.8%(1/54);GA高于16.87%占25.9%(14/54)。结论 FBG和HbA1c对于肝源性糖尿病诊断的特异度高,灵敏度低,GA对于肝源性糖尿病诊断的灵敏度高,但特异度低,所以对肝源性糖尿病的诊断三个检测指标结合使用更有价值。

离子交换层析分离纯化重组人血清白蛋白

通过层析实验 ,比较了几种阴离子交换剂在不同温度、p H值、离子强度、进样流速、进样浓度下对人血清白蛋白的吸附与脱附性能 ,研究了它们对人血清白蛋白和卵清蛋白的分离能力 ,并考察了柱层析过程中吸附载体对重组人血清白蛋白和杂蛋白的分离选择性。实验结果表明 :牌号为DEAE Sepharose FF的载体不仅对重组人血清白蛋白具有良好的分离度 。

重组人血清白蛋白生产工艺研究进展

人血清白蛋白是一种重要的临床药物 ,人源血浆白蛋白可能会传染病原体将逐步被重组白蛋白所代替。对用巴斯德毕赤酵母生产重组人血清白蛋白的表达系统、发酵方法。

重组人血清白蛋白表达研究进展

本文综述了重组人血清白蛋白在细菌 ,酵母 ,植物和动物等表达系统中表达的研究进展。用酵母表达系统 ,尤其是毕赤酵母 ,表达的重组白蛋白产量高且提取工艺简单 ,是其产业化最具有前途的表达系统。同时在转基因动物、植物中培养表达也具有诱人的前景。

发酵液中重组人血清白蛋白的纯化

采用摇瓶培养重组毕赤氏酵母(Pichia pastoris)表达并分泌重组人血清白蛋白(recombinant human se- rum albumin rHSA)至胞外,发酵液经(NH4)2SO4沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤分离纯化rHSA,纯化样 品经SDS-PAGE检测为单一条带。

重组人血清白蛋白发酵过程表达期的定量研究

结合元素平衡和代谢平衡 ,建立了重组人血清白蛋白发酵过程表达期的数学模型 ,按单纯形多变量最优化方法估算了模型的未知参数 ,并探讨了导致表达期不同阶段产物形成速率存在差异的可能原因。该模型能较好地描述重组人血清白蛋白发酵过程表达期中各宏观反应速率之间的关系 ,为重组人血清白蛋白的高效表达提供了线索。

植物表达重组蛋白的N-糖基化研究进展

分子农业中,植物作为生物反应器生产药用重组蛋白是近十几年来基因工程研究的一大热点。植物具有完整的真核表达系统、重组蛋白通常可以正确组装、折叠和修饰,同时,由于植物表达体系的方便、廉价等优点,利用转基因植物生产药用蛋白的研究迅猛发展,已有100余种蛋白中得到表达,有些已进入商业化生产。但是植物与动物对蛋白的转译后修饰并不是完全保守的,植物是否能够真正“忠实”地表达出实用、可靠的目的蛋白产品已成为备受瞩目的话题,由于大多数药用蛋白都是分泌型蛋白,因此植物表达重组蛋白的N-糖基化成为新的研究热点。笔者对植物表达体系对药用蛋白的N-糖基化修饰途径和人源化改造植物表达重组蛋白的研究进展两个方面加以综述,并对生物反应器的未来发展方向进行了探讨和展望。

酵母表达重组人血清白蛋白检测方法的比较

应用生化法、电泳扫描结合Bradford法、竞争ELISA等3种方法检测酵母表达重组人血清白蛋白(rHSA)的表达量。结果表明,3种方法检测结果近似。比较而言,生化法灵敏度较低,但操作简便,价格低廉;竞争ELISA法灵敏度最高,但需要特异的抗体;电泳扫描结合Bradford法需要特殊仪器,操作繁琐,花费时间长,灵敏度介于生化法和竞争ELISA法之间。综合利弊,生化法可作为检测酵母表达rHSA的首选方法,如条件允许,可考虑采用电泳扫描结合Bradford法或竞争ELISA。

重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在PichiaPink系统中的表达

目的:比较PichiaPink表达系统和巴斯德毕赤酵母GS115在表达外源蛋白方面的差异,对PichiaPink表达系统的潜在优点进行评价。方法:以重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(HSA-IFN-α2b)为报告蛋白,构建相关载体,分别转化PichiaPink系统菌株和巴斯德毕赤酵母GS115菌株,诱导HSA-IFN-α2b表达并测定表达水平;通过SDS-PAGE检测HSA-IFN-α2b在PichiaPink系统中的降解程度。结果:PichiaPink系统几乎所有的转化子都可以表达HSA-IFN-α2b,而GS115菌株只有60%的转化子能表达HSA-IFN-α2b;同一种Pink菌株中,整合有高拷贝数表达载体pPink-HC的菌株表达量高于整合有低拷贝数表达载体pPink-LC的菌株;Pink蛋白酶缺陷菌株在复杂培养基(YPD,BMMY)中HSA-IFN-α2b基本没有降解,而在合成培养基(BSM)中降解现象明显。结论:PichiaPink表达系统产生的转化子较GS115菌株产生的转化子易于筛选;PichiaPink系统蛋白酶缺陷菌株可明显减少外源蛋白降解。这些结果为利用PichiaPink表达系统高水平和大规模制备外源蛋白提供了实验依据。

人血清白蛋白及其重组表达研究进展

人血清白蛋白在医疗方面有广泛的应用,其可作为血容量扩张剂和辅助治疗剂、培养基组分和保护剂、药物制剂、诊断试剂和医疗器械包被剂等。基因重组技术提供了一种规模制备人血清白蛋白的有效途径,并已建立了多种人血清白蛋白的重组表达系统。本文综述了重组人血清白蛋白在细菌、真菌、转基因植物和转基因动物等表达系统中的发展和应用概况。

重组生长激素与人血清白蛋白治疗肝硬化低蛋白血症的疗效比较

目的 :比较应用重组人生长激素 (rhGH)和人血清蛋白 (HSA)治疗肝硬化低蛋白血症的疗效。方法 :分别对 6 6例住院肝硬化患者应用rhGH4 5U皮下注射 ,每天 1次 ,共 10次 ,或 2 0 %HSA5 0mL ,静脉滴注 ,每天 1次 ,共 10次。在治疗前后动态观察临床表现和检测各项肝功能指标。结果 :无论应用rhGH或HSA ,患者在治疗后精神、睡眠、食欲都有好转 ,腹胀减轻 ,腹水和下肢浮肿消退或减轻。ALT和AST明显下降 ,肝功能恢复正常。白蛋白含量有明显的升高达至正常水平。结论 :和HSA比较 ,rhGH治疗肝硬化低蛋白血症同样有较好的疗效 ,能明显提高白蛋白含量并有较长的疗效 ,费用较低 。

重组人血清白蛋白抗体检测方法的建立及确证

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、操作简单快捷、通量高的重组人血清白蛋白(rHSA)抗体检测方法。方法:采用桥连ELISA法,即将rHSA包被于96孔板,加入待测血样及阳性对照,用辣根过氧化物酶标记的rHSA检测,显色读取D450nm/D570nm值;用此方法确定临界值、方法灵敏度、精密度、血药浓度对检测方法的影响,再以免疫清除法进行确证。结果:通过桥连ELISA法确定临界值为0.0492,方法灵敏度为352 ng/mL,方法板间、板内精密度均小于20%,且血药中的rHSA浓度为20μg/mL时不影响抗体的检测;经免疫清除法可将假阳性样本排除,从而提高了方法的特异性。结论:建立的方法可以准确、快速地检测出rHSA的特异性抗体。