植物细胞中瞬时表达系统的建立及研究进展

瞬时表达是近年来发展的一种快速、高效的检测蛋白质表达的方法,并逐渐被应用到生物学各方面的研究中。植物细胞瞬时表达系统的建立为方便、快捷的研究启动子活性、基因功能和蛋白质定位等开辟了新途径。本研究主要归纳了植物瞬时表达系统的建立和发展过程,总结了近年来的应用以及对生物学研究的意义,并指出了该系统在当前应用中存在的不足,并针对这些不足提出了合理的建议。最后,结合最新的研究进展,对瞬时表达系统在分子细胞生物学、蛋白质组学、病毒学等方面的研究工作做了展望。

五种豆科植物WRKY基因家族全基因组鉴定及表达分析

为了增强对豆科植物WRKY基因的多样性和进化上的认识,探索WRKY转录因子家族成员的功能和在育种中的应用。在本研究中,利用生物信息学方法对5种豆科植物大豆、鹰嘴豆、菜豆、蒺藜苜蓿及百脉根的WRKY基因进行了染色体定位、系统进化、保守基序、基因结构和基因复制等方面的分析。从上述5种豆科植物中分别鉴定出185、61、90、108和83个WRKY基因。将5种豆科植物WRKY蛋白分为三类和五个亚类,同一亚类具有相似的蛋白结构和基因结构。5种豆科植物的WRKY基因家族成员中存在基因复制事件,并且在各个组织中有明显差异表达。WRKY基因在不同组织中的表达模式表明,它们可能在豆科植物的生长发育中发挥重要作用。

利用烟草瞬时表达系统检测高等植物基因的剪接加工

解析基因的剪接加工机制是了解植物形态建成、生长发育和逆境胁迫应答的重要环节.与动物相比,植物中相应的研究进展较为缓慢.利用农杆菌介导的烟草瞬时表达系统,分别对单子叶植物水稻BADH2和双子叶植物拟南芥GR7基因片段在烟草叶片中的转录后剪接加工进行分析.结果表明,一些重要剪接调控元件在植物中保守存在,而烟草瞬时表达系统可以作为研究高等植物剪接调控的重要工具,快捷灵敏地检测基因的剪接加工方式.

农杆菌介导注射法建立番茄子叶瞬时表达系统

背景:转基因植物生产口服疫苗具有较大的优势及广阔的应用前景。目前,关于番茄瞬时表达系统的研究罕见报道,对番茄瞬时表达条件进行优化,可使植株的遗传转化效率大幅度提高。目的:利用农杆菌介导的注射法,建立番茄子叶瞬时表达系统,检测植物表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8中外源基因的转录水平。方法:通过对番茄无菌苗的培育,观察不同番茄品种的出芽数、成苗数及农艺学性状的差异显著性,筛选出适用于此实验的番茄品种,将前期构建的植物表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8转化到农杆菌EHA105中,通过对番茄子叶、注射农杆菌浓度、农杆菌注射量、生长苗龄以及共培养天数进行筛选,建立农杆菌介导的番茄子叶瞬时表达系统,观察报告基因的转录水平。结果与结论:初步建立番茄子叶瞬时表达系统,筛选出适合的番茄品种为欧洲大红(苹果型),选材部位为番茄的子叶,注射农杆菌浓度A600为0.2-0.7,农杆菌注射量为50μL,苗龄为7-10 d,共培养24-48 h。该实验为后期外源基因蛋白表达分析研究提供一种方便、快捷和有效的方法。

植物中瞬时表达外源基因的新型侵染技术

由于瞬时表达系统的局限性使其不利于规模化生产的应用,本文介绍了一种新型的瞬时表达侵染技术—种子吸收法在植物中进行外源蛋白的表达。利用种子自然吸收来源于TMV病毒载体的农杆菌重悬液在番茄中成功的表达了报告基因GFP,并优化了影响基因表达的各种因素,包括菌液重悬液浓度和其他侵染条件。与其它侵染方法相比,该方法具有独特优势,如操作过程简便,有利于外源蛋白的规模化生产,并能够进一步扩大植物生物反应器的宿主范围。我们推测种子吸收法将有利于重组药用蛋白在植物中的工业规模化生产。

一种基于植物瞬时表达研制新冠病毒重组蛋白疫苗的方法

目的:探究一种以植物烟草为瞬时表达载体快速且高效研制和表达SARS-CoV-2重组蛋白疫苗的方法。方法:培育植物烟草,当烟草生长到第6周时,叶片生长到接近手掌大小,可用于下一步的农杆菌渗透。构建包含SARS-CoV-2 S重组质粒的农杆菌。培养含目的基因的农杆菌,来获得农杆菌渗透液。选择待渗透的目标叶片,用针头轻轻在叶片上刺穿一个小孔,然后将制备好的农杆菌渗透液注入叶片,使其慢慢吸收渗透液。需要从渗透后的烟叶中提取和纯化SARS-CoV-2 S重组蛋白,并进行初步鉴定。对SARS-CoV-2 S重组蛋白进行纯化与鉴定,并对纯化的SARS-CoV-2 S重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果:采用植物烟草成功地表达SARS-CoV-2 S重组蛋白,其分子量约为53.2 kD,Western blot结果显示His-tag抗体可以识别SARS-CoV-2 S重组蛋白。结论:基于植物的瞬时表达系统可作为SARS-CoV-2重组蛋白疫苗的快速研制方法。

柑橘冷诱导基因及其启动子表达载体构建与瞬时表达分析

目的：以YFP为报告基因，构建柑橘冷诱导基因及其启动子的植物表达载体。方法：克隆获得枳冷诱导基因Ptcor8及其启动子pPtcor8，柠檬中同源基因Clcor8及其启动子pClcor8；双酶切含启动子的克隆载体和植物表达原始载体plD4，连接获得含启动子的中间载体；再双酶切含冷诱导基因的克隆载体和中间载体，连接后获得重组质粒；通过冻融法将重组质粒导入农杆菌EHA105中。

夏枯草苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是迷迭香酸合成途径中的关键酶之一,根据其他植物PAL基因的保守区域设计特异引物,利用3'-RACE-PCR技术,本研究首次从夏枯草中克隆得到了PAL基因的cDNA片段序列,命名为PvPAL,Gen-Bank登录号为JN65446。PvPAL基因cDNA片段长1 306 bp,其中编码区域为1 047 bp,编码349个氨基酸。蛋白质序列多重比较结果显示,PvPAL蛋白质序列与丹参、地黄、黄芩、藿香等植物的PAL蛋白质高度同源。PAL系统进化树分析结果表明,PvPAL与唇形科植物的PAL基因亲缘关系最近。组织表达分析结果显示,PvPAL基因在根、茎、叶中均表达,其中根中表达量最高。PvPAL基因的克隆为进一步研究夏枯草迷迭香酸合成的分子机制奠定了基础。

甘草AQPs基因家族的鉴定及表达分析

水通道蛋白(AQPs)定位于质膜,在调控植物水分平衡中具有重要意义。甘草(Glycyrrhiza uralensis)是常用大宗药材,多生长于干旱环境,水分平衡对其生长影响极大。为了解AQPs在甘草中的作用,本研究以生物信息学方法对甘草水通道蛋白基因(GuAQPs)家族成员进行分析,结合转录组数据和qRT-PCR分析GuAQPs在非生物胁迫下的表达情况。结果表明,甘草基因家族中共有43个GuAQPs基因,主要分为PIPs、TIPs、NIPs和SIPs 4个亚家族,均含有MIP结构域和NAP基序、Ar/R过滤器及Froger位点,二级结构以无规则卷曲为主。GuAQPs基因启动子区含有响应激素、逆境的顺式作用元件。qRT-PCR结果显示GuTIP2;3在干旱处理或ABA处理后叶和根中都显著上调表达(P <0.05);GuSIP1;4和GuNIP6;1在盐胁迫后叶和根中都显著上调表达(P <0.05),而施加盐胁迫后GuTIP4;1在根中显著下调表达(P <0.05);低温处理下GuNIP6;1和GuSIP1;2在根和叶中都显著下调表达(P <0.05)。通过甘草全基因组中的水通道蛋白基因的鉴定和表达分析,初步了解不同逆境胁迫对甘草AQPs的影响,为进一步研究甘草生长发育的分子机理提供理论基础。

与酵母单杂交系统匹配的植物瞬时表达分析载体的构建

为了在植物细胞/原生质体中验证酵母单杂交系统解析的植物转录因子及其关键结构域,本研究构建了一套与酵母单杂交系统相匹配的植物瞬时表达分析系统,并在拟南芥叶片原生质体中进行了瞬时表达分析。结果显示,以AtDPBF4的转录激活区(CR Ⅱ)构建的效应载体可在拟南芥原生质体中激活报告基因GUS的转录。这一结果与AtDPBF4的CR Ⅱ在酵母细胞中的结果一致。报告载体中,含有6个UASGal1的杂合启动子可引发下游报告基因GUS转录的酶活性达0.96 nmol 4-MU·mg^(-1)·min^(-1);含有3个UASGal1的杂合启动子可引发GUS基因的酶活性达0.73 nmol 4-MU·mg^(-1)·min^(-1)。含有6个UASGal1的杂合启动子的强度明显强于含有3个UASGal1的杂合启动子,但其活性并不是3个UASGal1杂合启动子的2倍,仅比其活性高了31.5%。由此表明,在报告基因中增加GAL4结合位点(UASGal1)的重复序列可以提高下游报告基因的表达,但是这种活性升高趋势并不与UASGal1的重复数量呈线性关系。

植物甜菜碱醛脱氢酶基因研究进展

对近年来植物甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的研究现状进行了系统分析。对目前已分离到的10个不同种植物BADH基因的序列分析发现:该基因编码区序列趋于保守;在不同物种间存在拷贝数不同的差异;其表达也存在转录或转录后水平的差异,具有组织特异性、组成型和诱导型的不同表达类型;氨基酸序列同源性反映的种间关系与这些种的系统分类位置一致,表明该基因的进化与植物的系统进化间具有密切关系。此外,还对信号肽区域、外显子剪切位点以及BADH定位的变化等进行了分析。

草甘膦诱导表达的大豆与棉花EST序列的分离

利用差异显示PCR方法分离了63个草甘膦诱导后在大豆和棉花中差异表达的片段,测序分析结果表明属于33个草甘膦诱导的大豆和棉花EST序列。通过在GenBank中进一步比时研究发现:约85%的EST序列与水杨酸、冷、创伤、氧化等非生物胁迫诱导后表达库中的EST序列有高达95%以上的同源性,由此可推测这些基因参与了植物对非生物胁迫的反应过程。草甘膦诱导后高表达EST、序列的获得将有利于进一步分离相关非生物胁迫诱导表达基因及启动子,研究其转录调控的机理,有望建立草甘膦诱导系统。从而解决组成型表达造成外源基因在植物体所有发育阶段和所有组织部位表达,造成植物体能量浪费。

花花柴抗逆相关转录因子WRKY的鉴定及分析

WRKY转录因子作为参与生物或非生物胁迫应答的重要基因家族,在植物逆境胁迫的响应过程中起着重要作用。花花柴作为沙漠植物,具有极强的广谱抗逆性,发掘并应用花花柴的抗逆基因资源对研究植物逆境生物学及抗逆性分子育种具有重要意义。本研究通过对沙漠植物花花柴的转录组学分析,筛选出与高温胁迫相关的15个差异表达的WRKY基因。并将这15个基因与拟南芥、水稻的WRKY基因构建系统发育树,通过对同亚族同源性较高的基因功能及其顺式作用元件的功能预测,推测花花柴WRKY基因可能参与了极端温度、干旱、高盐、病原菌等逆境胁迫响应,并对与高温胁迫响应相关的2个花花柴WRKY基因进行表达模式分析。该结果将为荒漠植物及其基因资源的发掘利用提供一定的参考价值。

利用植物系统表达重组蛋白的研究进展

植物是可以生产不同生物药剂品的成本低廉的生物反应器,综述了稳定转化系统、瞬时表达系统以及叶绿体基因组转化方法,这三种不同的植物表达系统的特点和研究现状,并对其存在的问题及未来的前景进行了分析。

农杆菌渗透法转化烟草条件的优化

植物瞬时表达系统常用于研究基因表达产物的亚细胞定位和蛋白间的互作,将GFP-GUS融合蛋白植物表达载体导入农杆菌EHA105,获得工程菌,制备不同浓度的农杆菌浸染液,用注射法对烟草叶片进行转化,荧光显微镜检测烟草叶片原生质体和下表皮中GFP的表达情况。结果表明,浸染注射液的D600 nm在0.3~0.7之间均具有较高的转化效率,注射后第4天至第6天为较佳观察时间。

转基因高γ-亚麻酸大豆油抗肿瘤作用的研究

γ-亚麻酸(GLA)是人体和动物饮食中具有营养作用的重要的多烯不饱和脂肪酸,在大多数油料作物种子中不含有GLA,而含有其前体物亚油酸。△6-脂肪酸脱氢酶可将亚油酸转化为γ-亚麻酸,为了能够在传统的油料作物大豆中产生GLA,将从深黄被孢霉中克隆的△6-脂肪酸脱氢酶基因,与植物表达载体pBIl21连接,构建了重组质粒pBIM16,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统,成功地将该基因导入到栽培大豆吉林47品种中,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。通过气相色谱(GC)对大豆种子进行脂肪酸成分分析,结果表明,产生了GLA,其含量最高可达36.585%。将高GLA的转基因大豆油口服给药,结果表明,其对小鼠S180肉瘤、肝癌H22和Ehrlich癌实体型的抑瘤率分别为32.63%、31.91%和34.34%。其肿瘤抑制率均>30%,与对照组比较有显著差异(p<0.01),表现初步的抗肿瘤作用。