与酵母单杂交系统匹配的植物瞬时表达分析载体的构建

为了在植物细胞/原生质体中验证酵母单杂交系统解析的植物转录因子及其关键结构域,本研究构建了一套与酵母单杂交系统相匹配的植物瞬时表达分析系统,并在拟南芥叶片原生质体中进行了瞬时表达分析。结果显示,以AtDPBF4的转录激活区(CR Ⅱ)构建的效应载体可在拟南芥原生质体中激活报告基因GUS的转录。这一结果与AtDPBF4的CR Ⅱ在酵母细胞中的结果一致。报告载体中,含有6个UASGal1的杂合启动子可引发下游报告基因GUS转录的酶活性达0.96 nmol 4-MU·mg^(-1)·min^(-1);含有3个UASGal1的杂合启动子可引发GUS基因的酶活性达0.73 nmol 4-MU·mg^(-1)·min^(-1)。含有6个UASGal1的杂合启动子的强度明显强于含有3个UASGal1的杂合启动子,但其活性并不是3个UASGal1杂合启动子的2倍,仅比其活性高了31.5%。由此表明,在报告基因中增加GAL4结合位点(UASGal1)的重复序列可以提高下游报告基因的表达,但是这种活性升高趋势并不与UASGal1的重复数量呈线性关系。

农杆菌渗透法转化烟草条件的优化

植物瞬时表达系统常用于研究基因表达产物的亚细胞定位和蛋白间的互作,将GFP-GUS融合蛋白植物表达载体导入农杆菌EHA105,获得工程菌,制备不同浓度的农杆菌浸染液,用注射法对烟草叶片进行转化,荧光显微镜检测烟草叶片原生质体和下表皮中GFP的表达情况。结果表明,浸染注射液的D600 nm在0.3~0.7之间均具有较高的转化效率,注射后第4天至第6天为较佳观察时间。