植物细菌诱导型表达载体的构建

根据GenBank中细菌诱导型启动子的碱基序列设计一对引物,通过PCR扩增出启动子PPP3(AF469483,220bp).经分子操作将启动子和质粒pUC18连接后转化E.coliDH5α,经蓝白筛选和PCR检测筛选阳性菌落,测序结果与Genebank中的碱基序列完全相同.对扩增到的PPP3片段和含目的基因(hrap或pflp)的pBI121质粒进行双酶切,分别回收PPP3片段和含目的基因的pBI121大片段,连接后转化E.coliDH5α,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,表明细菌诱导型启动子和目的基因已正确连接.用重组质粒转化农杆菌,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,证明植物细菌诱导型表达载体构建成功.

Prd29A及DREB1A的克隆和干旱诱导型植物表达载体的构建与鉴定

从拟南芥中克隆了RD29A 基因的启动子(Prd29A)及DREB1A 基因的DNA 片段,构建Prd29A:DREB1A 融合基因,采用合成的接头将该融合基因插入到植物表达载体pBI121 中,经鉴定,确认正确。

逆境诱导型启动子rd29A的克隆及植物表达载体的构建

根据文献上发表的逆境诱导型启动子rd2 9A序列设计并合成了一对引物 ,通过PCR的方法从拟南芥基因组中扩增到rd2 9A的启动子序列。根据GenBank中已发表的转录因子DREB1A基因的cDNA序列设计并合成了一对引物 ,通过RT PCR的方法从低温处理的拟南芥总RNA中扩增出DREB1A基因的全长cDNA片段。以植物表达载体pBch为基础 ,构建了由rd2 9A调控的DREB1A基因的植物表达载体pBDR2 9A 。

玉米逆境诱导型启动子克隆及其植物表达载体构建

设计特异引物,利用PCR方法从玉米(Zea mays)基因组DNA中克隆低温和盐相应蛋白(low temperature andsalt responsive protein,LS)基因上游1 735 bp,命名为Lsp。利用在线启动子预测工具PlantCARE分析表明,序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还包含各种胁迫响应元件。以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将克隆得到的启动子片段与GUS报告基因融合构建了重组表达载体pCAM-Lsp,并用反复冻融法将其导入农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法转化烟草,GUS组织化学染色显示出Lsp驱动GUS基因表达。结果表明,该Lsp启动子片段具备一定的启动活性,为探明玉米逆境胁迫启动子表达调控序列及其调控机制的研究奠定基础。

逆境诱导型启动子Mvnhx1缺失片段植物表达载体构建

Mvnhx1启动子是一种与盐胁迫和干旱胁迫相关的逆境诱导型启动子。为了更好地研究顺式作用元件对Mvnhx1启动子功能特点的影响,研究根据启动子序列上与耐盐和耐旱相关的顺式作用元件分布位置不同设计引物,利用5'端缺失技术获得11个不同长度的Mvnhx1启动子缺失片段,分别构建不同缺失片段与报告基因GUS融合的植物表达载体。PCR扩增结果显示,成功克隆获得11个长度分别为1 135、1 027、974、967、858、727、726、564、366、352和210 bp的片段。酶切鉴定显示,成功构建了由Mvnhx1启动子11个不同长度缺失片段调控的带GUS基因的植物表达载体。

CBF1转录因子基因的克隆及两种启动子调控下的植物表达载体的构建

CBF1转录激活因子能调控一组抗干旱、抗低温基因的表达,更有效地提高植物抗干旱、抗低温的能力。现在国内外许多研究机构已经利用导入该转录因子来提高植物的抗寒性、抗旱性,并且获得一定的成功,但在园林植物上的应用还有待探讨。因此,本研究以拟南芥叶片为材料,通过PCR方法对其基因组DNA扩增,成功地克隆了逆境诱导型启动子和CBF1转录因子并分别构建了花椰菜花叶病毒CaMV35s启动子和rd29a启动子调控下的CBF1融合基因表达载体,为下一步转化园林植物,利用CBF1基因综合改良园林植物抗逆性及进一步探讨CBF1基因的抗逆分子机理奠定了物质基础。