烟草植物螯合肽合成酶PCS1基因的电子克隆和序列分析

为了研究烟草中重金属镉的代谢转运基因,以马铃薯的植物螯合肽合成酶phytochelatin synthases 1(PCS1)基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:AJ548472.1)为信息探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种中克隆到1个植物螯合肽合成酶基因(NtPCS1),并对其进行了序列分析。序列分析结果:NtPCS1包含完整的开放读码框,编码531个氨基酸,含有2个保守域Phytochelatin_C和Phytochelatin;通过同源比对和进化分析发现,NtPCS1氨基酸序列与番茄PCS1的序列一致性达到85%,与已报道的树烟草NgPCS相比,在N端多出30个氨基酸。以上结果表明NtPCS1是栽培烟草中新发现的金属镉代谢转运基因。

植物螯合肽合成酶的催化机制研究进展

植物螯合肽合成酶(phytochelatin synthase,PCS)可在重金属离子激活下,以谷胱甘肽(GSH)及其巯醇盐为双底物催化合成植物螯合肽(phytochelatins,PCs),从而解除生物体内重金属的毒性。远源同源蛋白分析揭示了PCS属于木瓜蛋白酶超家族,其催化机制类似于Cys蛋白酶。

类植物螯合肽的原核表达与Zn^(2+)螯合能力分析

参照酶法合成的植物螯合肽序列,设计和人工合成了类植物螯合肽基因PC11L-H的编码序列,重组进pET32a(+)后在大肠杆菌中表达,经IPGT诱导,能够丰量表达出N端带有Trx融合肽的类植物螯合肽PC11LH,且使大肠杆菌对Zn2+的螯合能力提升了2.35倍,与对照的差异达到极显著水平,表明PC11L-H具有很强的Zn2+螯合能力.

植物螯合肽合成酶的研究进展

植物螯合肽(phytochelatins,PCs)在植物解除重金属的毒性方面具有重要作用,其结构为(γ-Glu-Cys)n-Gly(n=2～11),它不是基因的编码产物,而是在植物螯合肽合成酶(phytochelatin synthase,PCS)的催化下以谷胱甘肽(glutathione,GSH)为底物合成的。PCS能够被金属离子激活,高度保守的N-端是催化结构域,而其C-端则是多变的。本文就PCS的结构,功能与催化机制以及PCS的最新研究进行了介绍。

AtPCS1基因表达载体构建与转化苜蓿的研究

扩增拟南芥（Arabidopsis thaliana）螯合肽合成酶（AtPCS1）全长基因;构建AtPCS1植物表达载体pBⅠ121-AtPCS1,进一步转化农杆菌EHA105;利用转化的农杆菌EHA105侵染甘农一号苜蓿（Medicago sativa）叶片,经过80~100 d的筛选与培养,获得57株再生转基因植株。随机抽取其中9株进行PCR检测,其中6株为阳性。初步结果表明,AtPCS1基因已整合到苜蓿基因组中。

农杆菌介导AtPCS1基因转化苜蓿

利用RT-PCR扩增拟南芥螫合肽合成酶(AtPCS1)基因全序列.进一步构建AtPCS1的植物表达载体pB I 121-AtPCS1,转化农杆菌EHA105;然后用转化的农杆菌EHA105以叶盘法侵染苜蓿甘农一号叶片,在50mg/L Kan的筛选压下,经过约80～100d的筛选,获得57棵再生苗.随机取其中9棵再生苗进行PCR检测,其中6棵为阳性.初步鉴定表明AtPCS1基因已整合到苜蓿基因组中.

AtPCS1基因的原核表达及多抗血清的制备

利用RT-PCR扩增拟南芥螯合肽合成酶(AtPCS1)基因全序列,构建原核表达载体pET28a- AtPCS1并测序.将该载体转化大肠杆菌BL21,用0.75 mmol/LIPTG诱导融合蛋白AtPCS1-His的表达,纯化该融合蛋白.用纯化的融合蛋白免疫小鼠,ELISA法测定抗血清的效价可达1:2 000.抗血清与融合蛋白及拟南芥总蛋白的western-blot结果表明:制备的抗血清具有较高的活性和特异性.

苜蓿遗传转化体系的优化与AtPCS1基因表达载体的构建

通过对6种不同基因型苜蓿愈伤组织的形成能力、愈伤组织的分化能力的比较发现,不同苜蓿品种间的分化率存在显著差异(P<0.05),其中甘农1号分化率最高(42.9%);对甘农1号叶片、下胚轴及子叶等外植体的分化再生能力研究发现,叶片起源的愈伤组织分化时间短,且丛生芽形成数量高于下胚轴和子叶;再生芽可在B5培养基上成苗,并在蔗糖浓度为10 g/L的1/2 MS培养基上顺利生根.据此认为,苜蓿甘农1号叶片是适于做遗传转化的理想材料.利用RT-PCR方法扩增拟南芥螯合肽合成酶(AtPCS1)基因全序列构建了AtPCS1的植物表达载体pBI121-AtPCS1,为下一步AtPCS1基因转化苜蓿奠定了基础.

裂殖酵母SpHMT1基因对拟南芥镉耐受性的影响

为分析裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)重金属耐受因子基因SpHMT1(heavy metal tolerance factor 1)在拟南芥(Arabidopsis thaliana)镉耐受中的功能,通过在模式植物拟南芥中成功过量表达裂殖酵母跨液泡膜转运的PCs-Cd复合物重金属耐受因子基因SpHMT1,发现SpHMT1能增强植物对镉、砷、铜、锌等重金属的耐性和积累,并且对Cd^(2+)的耐性和积累能力受到L-buthioninesulfoximine(BSO)的抑制。SpHMT1在拟南芥中定位于液泡膜上,能量发散X-射线微量分析(Energy-dispersive X-ray,EDX)发现转基因植物中硫元素(Sulfur,S)更多地存在于液泡中,说明SpHMT1在拟南芥中的功能依赖于植物螯合肽(Phytochelatins,PCs)。结果表明,SpHMT1延迟了重金属Cd^(2+)从根到茎的长途转运,延缓了Cd^(2+)在植株地上部分的积累。

表达长喙田菁SrPCS4烟草的获得及Cd抗性研究

植物螯合肽(phytochelatins,PCs)在植物解除重金属的毒性方面具有重要作用,是以谷胱甘肽为底物,在植物螯肽合成酶(phytochelatin synthase,PCS)催化下合成的.作者已经克隆得到的长喙田菁(Sesba-nia rostrata)植物螯合肽合成酶SrPCS4 cDNA长为1035 bp,其ORF编码177个氨基酸,以pHANNIBAL及pART27为基础,构建了CaMV35S启动子驱动的SrPCS4基因植物表达载体pAM25,采用电击转化方法将pAM25导入根癌农杆菌EHA105,并通过改良叶盘转化方法用该菌株对烟草进行了转化,对转基因烟草进行了PCR与northern-blot检测,研究结果表明得到了表达该基因的烟草,但表达该基因的烟草不能够提高对Cd的抗性.

青藏高原东北部及其邻近地区无苞香蒲的谱系地理学

第四纪冰期气候的反复变化对青藏高原及邻近地区植物的种群地理分布及种群遗传结构产生了巨大的影响。本研究对青藏高原东北部及其邻近地区无苞香蒲(Typha laxmannii)的15个种群148个个体的叶绿体rpl32-trn L间隔区和核基因(植物螯合肽合成酶,PS)进行测序,共发现2个叶绿体单倍型和8个核基因单倍型。所有的单倍型被共享,高原种群没有特有的单倍型。邻近地区种群的叶绿体遗传多样性和核基因遗传多样性分别是高原种群的4倍和2倍。高原种群的遗传分化水平明显高于邻近地区种群,其中高原种群的遗传分化主要存在于东部种群与西部种群之间。研究结果表明,冰期后从多个避难所回迁至高原台面和由此产生的奠基者效应造成了无苞香蒲在青藏高原东北及邻近地区目前的遗传多样性和基因谱系地理分布格局。