植物转脂蛋白的抗病机制研究进展

植物受病原菌侵染后会诱导病程相关蛋白的表达,抑制病原菌的生长和蔓延,并产生系统性获得抗性．目前已确定的病程相关蛋白有14种,植物转脂蛋白被列入其中．关于转脂蛋白的作用尽管已争论多年,但其准确的生理功能及作用机制至今仍不十分明确．近年来人们将焦点集中在转脂蛋白抗性功能与机制的研究上．文中介绍了目前这一领域的研究进展,并根据该室的研究结果,提出钙调素可能参与植物转脂蛋白抗性功能的调节,为全面阐明转脂蛋白的抗病机制提供了新的研究线索．

白菜转脂蛋白CaMBP10分子中钙调素结合结构域的鉴定

植物转脂蛋白(LTPs)是多基因编码的蛋白家族,广泛分布于高等植物,其确切的生理功能至今仍不清楚.本室从白菜中分离的钙调素结合蛋白-10(CaMBP10)经序列分析被鉴定为植物转脂蛋白家族成员,体外实验证明钙调素(CaM)调节其脂质结合活性.为了深入了解转脂蛋白与CaM的相互作用机制,本文通过删除、缺失和定点突变等分子生物学手段确定了白菜转脂蛋白CaMBP10分子中的钙调素结合结构域.该结构域位于分子C末端64～83位氨基酸残基之间,其中疏水氨基酸的分布具有1-5-8-10的CaM结合模序特征.

豌豆质膜内源CDPK对植物转脂蛋白CaMBP-10的磷酸化及CaMBP-10对激酶自磷酸化的影响

植物转脂蛋白(LTPs)是多基因编码的蛋白家族,广泛分布于高等植物.虽然LTPs的确切功能至今仍不完全清楚,但它参与植物生物、非生物胁迫反应以及它的抗性功能已成为近年来的研究热点.关于LTPs功能的调节机制目前几乎一无所知.最近,从白菜中分离的钙调素结合蛋白-10(CaMBP-10)被鉴定为植物转脂蛋白家族成员,并且,体外实验证明钙调素(CaM)调节其脂质结合活性.为了深入了解转脂蛋白功能的调节机制,本文研究了CaMBP-10的磷酸化作用,发现CaMBP-10可被豌豆质膜内源性蛋白激酶磷酸化,钙离子(Ca2+)能刺激磷酸化,钙螯合剂EGTA以及CaM拮抗剂W-7和TFP均能显著抑制磷酸化.免疫印迹分析最终确定该激酶为CDPK家族成员.构建突变体进一步研究了CaMBP-10的磷酸化位点,发现其位于蛋白的C-末端区域,并与已确定的CaM结合位点重合.同时,分析结果表明CaM能抑制CaMBP-10的磷酸化.反之,CaMBP-10的磷酸化又能阻断其与CaM的结合,显示出两种调节方式相互竞争的特点.为深入研究磷酸化作用对CaMBP-10脂质结合活性的影响,构建突变体(Ser83Asp,Ser85Asp)以模拟磷酸化状态.实验结果显示,磷酸化作用能显著增强CaMBP-10的脂质结合活性,而且突变体的脂质结合活性不受CaM的影响.采用胶内磷酸化测定法(in-gelkinaseassay)研究了激酶的自磷酸化特点以及CaMBP-10对激酶自磷酸化的影响,发现CaMBP-10能激活激酶的自磷酸化,激酶的自磷酸化又能促进其对底物的磷酸化作用.这样,激酶的自磷酸化与底物的磷酸化形成一种"正反馈环"的调节模式.综合研究结果,本文首次证明了LTP受CaM结合和CDPK磷酸化的双重调节.而且,CaM结合位点与磷酸化位点的重合预示可能存在特殊的调节机制,以协同应答胞内的Ca2+信号.

组蛋白激活拟南芥CDPK催化CaMBP10的体外磷酸化反应

植物转脂蛋白(plant lipid transfer proteins,LTPs)是高等植物中广泛存在的多基因编码的小分子碱性蛋白.本研究室已经证明白菜和豌豆LTPs可分别被内源胞浆可溶性和膜结合钙依赖性蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)磷酸化.为深入研究CDPK对白菜钙调素结合蛋白10(calmodulin-binding protein-10,CaMBP10)的磷酸化性质及特征,本文从拟南芥可溶性蛋白粗提物中检测到1个分子量约为54 kD的CDPK对CaMBP10有磷酸化作用.研究表明,组蛋白可增强CDPK对CaMBP10的磷酸化活性,促进磷酸化进程.而且组蛋白和Ca2+对CDPK具有协同调节效应,二者共同作用时比Ca2+单独作用时,激酶的活力增强约12倍.此外,不同组蛋白对CDPK的激活能力不同,组蛋白1对该激酶活性的激活能力要比组蛋白3高约8倍.