薰衣草非特异性脂质转移蛋白基因nsLTP2-1和nsLTP2-2的克隆与功能分析

非特异性脂质转移蛋白(nsLTP,non-specific lipid transfer proteins)在植物脂质转运和分泌中发挥重要作用。本研究从薰衣草(Lavandula angustifolia)中克隆到2个II型nsLTP基因,命名为nsLTP2-1和nsLTP2-2,并对其进行功能分析。生信分析表明,nsLTP2-1和ns LTP2-2分别编码119个和117个氨基酸,具有脂转移蛋白(LTP,lipid transfer proteins)保守结构域和8个高度保守的半胱氨酸残基;系统进化分析显示它们处于两个分支,与同科的紫苏(Perilla frutescens)相似性最高。基因表达分析显示2个基因均在花蕾中高表达,在叶片、茎和花瓣中几乎不表达,在花萼中的表达存在差异,nsLTP2-1和nsLTP2-2分别在成熟花萼和幼嫩花萼中表达量更高;2个基因在花蕾和叶片中的表达均受到强光诱导,且在花蕾中的表达均受脱落酸诱导,而叶片中nsLTP2-1和nsLTP2-2的表达分别受茉莉酸甲酯和乙烯诱导。亚细胞定位显示2个nsLTPs均定位在细胞膜和细胞壁上,可能与次生代谢物的转运有关。过表达nsLTP2-1和nsLTP2-2烟草叶片经尼罗红染色后,经485~543 nm激发光激发,叶片腺毛头部的荧光显示多于野生型,说明本研究中的nsLTPs可能在脂类的合成和转运中起重要作用。这些结果为明确薰衣草脂转移蛋白在脂类及萜类转运中的功能研究提供了参考。

牡丹非特异性脂质转移蛋白基因PsLTP的生物信息学分析

[目的]了解牡丹非特异性脂质转移蛋白基因LTP的基因特征及其编码蛋白的生物学特性,探索其生物功能。[方法]运用Blast、ORF-Finder、ProtParam、SignalP 4.1、ProtScale和TMHMM 2.0 Server等生物信息学软件,分析牡丹nsLTP基因序列及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、磷酸化位点、保守结构域等,并运用DANMAN、MEGA软件进行多序列比对和系统发育树构建。[结果]牡丹nsLTP基因(NCBI登录号为:JZ840269.1)序列全长为685 bp,开放阅读框长为354 bp,编码蛋白包含117个氨基酸,理论等电点为8.93,为不稳定性蛋白。牡丹nsLTP蛋白为疏水性蛋白,含有信号肽但不含跨膜结构域,NetPho Server预测其含有8个丝氨酸和3个酪氨酸磷酸化位点及5个苏氨酸磷酸化位点。PsnsLTP蛋白具有植物LTP蛋白典型结构,即4个α-螺旋,4对二硫键,1个可结合和容纳脂质分子的疏水结构。多序列比对及系统发育树分析显示,PsLTP蛋白与绒毛烟草LTP蛋白(XP_009608993.1)的相识度62.7%,且进化树聚为同一小分支,遗传距离较近。[结论]通过对牡丹nsLTP基因特性及蛋白结构研究,系统性研究了牡丹nsLTP基因的生物信息学特性,为牡丹抗病抗逆功能基因的研究提供了依据,也为其他植物nsLTP基因研究提供了参考。

马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa1的克隆和表达

非特异性脂质转移蛋白(nsLTP)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有多种生物学功能,如抗菌防御、信号传导、胞壁松弛、蛋白酶抑制等。通过接种青枯菌(Ralstonia solanacearum),从马铃薯栽培品种中薯3号中获得一个新的非特异性脂质转移蛋白cDNA克隆StLTPa1,序列分析表明该基因含636bp核苷酸,编码91个氨基酸,属于I类非特异性脂质转移蛋白。基于氨基酸序列构建的系统发生树揭示,该基因与其他茄科nsLTP具有高度保守的序列相似性,核酸和氨基酸水平分别具75%～85%和60%～92%的同源性。对该基因在互作早期基因表达时空性分析表明,StLTPa1基因不仅受病菌的诱导,在不同抗、感病的马铃薯基因型中差异表达,而且受一定浓度外源非生物激发子如水杨酸、茉莉酸和脱落酸的诱导并产生一定时间的持续效应,其诱导表达模式也表现出一定的差异。原位杂交结果显示StLTPa1主要在马铃薯茎、叶维管束系统的韧皮部细胞中表达。这些结果说明StLTPa1基因受病菌和非生物激发子诱导,在植物防御反应中发挥作用。

非特异性脂质转移蛋白突变体的构建及在两种硫氧还蛋白表达载体中的表达比较

对水稻非特异性脂质转移蛋白 (Nospecificlipidtransferprotein ,nsLTP)LTP110中结构重要的 5个氨基酸位点进行了定点突变 ,测序结果证实了突变体构建成功。在尝试了多种大肠杆菌表达系统进行表达之后 ,发现硫氧还蛋白融合表达载体适合于LTP110野生型及突变体的表达。将编码野生型LTP110及突变体Y17A ,P72L ,R46A ,D45A ,C5 0A蛋白的cDNA顺序克隆进两种硫氧还蛋白表达载体并对其表达情况进行了比较 :pTrxFus载体可以在宿主菌GI72 4中以较低水平表达野生型LTP110及突变体Y17A ,P72L ,R46A融合蛋白 ,但不能表达D45A和C5 0A融合蛋白 ;pET32a(+)载体可以在宿主菌BL2 1(DE3)trxB- 中以可溶蛋白的形式表达野生型及所有突变型融合蛋白 ,且表达量比在pTrxFus载体 GI72 4突主菌中表达量高。对pET32a(+)载体中表达的LTP110融合蛋白进行了纯化 ,并利用带有荧光标记的脂肪酸分子对其测活 。

烟草非特异性脂质转移蛋白基因的克隆与表达分析

为了阐明非特异性脂质转移蛋白基因Nt LTP1.1在烟草抗病抗逆反应中的功能,用c DNA末端快速扩增技术(Rapid-amplification of c DNA ends,RACE)从普通烟草中克隆了该基因全长,并通过生物信息学方法分析了c DNA序列结构、蛋白理化性质、保守基序、三级结构以及系统进化关系;利用q RT-PCR检测了该基因在不同组织中的表达模式以及胁迫条件下的表达差异。结果表明:Nt LTP1.1基因全长615 bp,编码蛋白含有129个氨基酸,为一种小分子碱性可溶性蛋白。蛋白序列N端含有信号肽,预测其可能定位于分泌途径中。Blast比对结果显示,烟草非特异性脂质转移蛋白与番茄ns LTP1序列相似性最高,含有8CM保守基序(8个半胱氨酸残基组成的保守基序)。蛋白三级结构预测表明,Nt LTP1.1具有ns LTP典型的三级结构,包括4个α-螺旋,4对二硫键,1个可结合和容纳脂质分子的疏水腔。多重比对结果显示,Nt LTP1.1 8CM结构域模式为C1-X9-C2-X13-C3C4-X19-C5XC6-X22-C7-X13-C8。系统进化分析结果表明,ns LTP进化形成5类,Nt LTP1.1属于Type I。表达模式分析显示,Nt LTP1.1基因主要在烟草叶片中表达,具有明显的组织表达特异性。在低温胁迫条件下表达受到抑制,在水杨酸诱导条件下表达上调。因此,推测Nt LTP1.1基因可能在烟草防御反应中发挥作用。

钙调素对钙调素结合蛋白-10和玉米非特异性脂转移蛋白与脂质结合活性的影响

荧光标记的脂质结合实验表明,钙调素结合蛋白-10(CaMBP-10)具有典型的植物非特异性脂质转移蛋白与脂质结合的特性。进一步实验研究了钙调素(calmodulin,CaM)对CaMBP-10和玉米nsLTP与脂质结合的活性的影响,结果显示无论在有钙和无钙条件下,CaM对两者的影响均有不同之处,W-7和TFP能消除CaM的影响。提示CaM不仅与CaMBP-10和玉米nsLTP特异性相互作用,而且对2种脂转移蛋白可能具有不同的调节机制。

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白编码序列的克隆及其盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein,nsLTP)EST序列,应用RACE技术克隆了具有PolyA的全长cDNA序列.该序列全长604bp,其5′非翻译区65bp,3′非翻译区227bp,开放阅读框编码103个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因,命名为PsnsLTPs;荧光定量PCR分析表明,PsnsLTPs在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达.在3%NaHCO3诱导表达下,该基因在地下茎中表达明显受盐胁迫的诱导,推测该基因在抵御盐胁迫时具有重要作用.

黄瓜非特异性脂质转移蛋白基因的序列分析及细菌性角斑病菌浸染下的表达

非特异性脂质转移蛋白(nsLTP)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有抗菌防御功能。分析黄瓜非特异性脂质转运蛋白基因nsLTP的序列特征及其在细菌性角斑病菌浸染过程中的表达模式,对其应用于黄瓜等农作物转基因工程,增强作物抗病性具有重要意义。在黄瓜叶cDNA文库中,获得非特异性脂质转移蛋白(nsLTP)cDNA序列,命名为CsnsLTP;该基因全长566 bp,编码121个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因。实时荧光定量PCR分析表明,CsnsLTP在黄瓜叶中有表达。在黄瓜细菌性角斑病菌浸染下,该基因在黄瓜叶中表达增高,并随浸染时间的延长而增强,明显受黄瓜细菌性角斑病菌的诱导,推测该基因在抵御黄瓜细菌性角斑病菌浸染时具有重要作用。

植物脂质转移蛋白

脂质转移蛋白(lipid transfer proteins,LTPs)是植物生命活动中一类重要的活性蛋白质,在体外能够可逆地结合和转运多种脂质分子。目前已从多种植物中分离到LTPs基因。随着研究的深入,其不同水平的转录本在不同植物的不同发育阶段和生理条件下的不同组织中被发现,但LTPs体内确切的生理、生化功能和作用机制尚不明确。现介绍目前这一领域细胞与分子生物学方面的研究进展,并结合本课题组的研究结果进行了相关探讨,为进一步研究LTPs在植物生殖发育、抗性和防御反应及信号转导中的作用机制提供了新的线索。

辣椒非特异性脂质转移蛋白基因CaLTP1的克隆及表达分析

非特异性脂质转移蛋白(nsLTPs)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有多种生物学功能。从辣椒cDNA文库中筛选得到1个nsLTPs基因,命名为CaLTP1;序列分析结果表明:该基因全长cDNA序列为1 211 bp,推测编码1个包含129个氨基酸残基的前体蛋白。CaLTP1蛋白含有典型的脂质转移蛋白N-端信号肽,保守的AAI结构域和半胱氨酸位点。预测CaLTP1蛋白含有多种功能位点,包括3个CK2磷酸化位点,3个N-豆蔻酰化位点和1个PKC磷酸化位点。实时荧光定量分析组织特异性表达模式表明,CaLTP1在辣椒茎、叶、花中表达量升高。

甘薯非特异性脂质转移蛋白基因克隆与表达分析（英文）

非特异脂质转移蛋白(ns LTP)是植物界普遍存在的一类涉及多种胁迫反应的可溶性蛋白。为了阐明甘薯中非特异性脂质转移蛋白基因IbLTP1和IbLTP2在盐胁迫反应中的功能,本研究运用PCR技术,对IbLTP1和IbLTP2基因进行了克隆,并通过生物信息学方法分析了序列结构、蛋白质保守结构域和系统进化关系;利用q RT-PCR方法检测了这两个基因在不同组织中的表达模式以及盐胁迫条件下的表达差异;将IbLTP1和IbLTP2基因克隆到大肠杆菌的原核表达载体p ET32a中,对重组菌BL21(p ET32a-LTP)的耐盐性进行分析。序列分析表明:IbLTP1和IbLTP2编码区均不含内含子并都具有等位基因。IbLTP1和IbLTP2基因的蛋白质序列分别包括114和94个氨基酸残基并且不含色氨酸残基,蛋白序列N端含有信号肽序列。保守结构域和系统进化分析结果表明:IbLTP1和IbLTP2均含有ns LTP蛋白的保守结构域,IbLTP1属于TypeⅠ而IbLTP2属于TypeⅡ。实时荧光定量PCR分析表明:IbLTP1在幼叶中表达量最高,根中表达量最低;而IbLTP2在茎中表达量最高,成熟叶中表达量最低。在Na Cl胁迫条件下,IbLTP1和IbLTP2表达量在根中基本无变化而在茎和叶中上调。大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达IbLTP1和IbLTP2基因能够提高转基因菌株对Na Cl的耐受性。因此,本研究推测IbLTP1和IbLTP2基因可能在甘薯盐胁迫反应中发挥了作用。

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白基因PsnsLTP的功能分析

通过在农杆菌介导下,利用西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白基因(植物表达载体:pROKII-PsnsLTP)对烟草进行遗传转化,经卡那霉素抗性分化筛选及PCR鉴定,获得6个转基因烟草株系。接种烟草炭疽病病菌和猝倒病病菌后观察转基因植株和野生型的表型差异,在Na Cl、Cd Cl2、7.5%PEG6000的胁迫下进行表型观察和生理指标的测定。结果显示:与野生型烟草相比,T1代转基因植株已具有较强的耐烟草炭疽病和猝倒病的能力;其超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性显著增强,丙二醛(MAD)含量显著降低,且幼苗具有较好的生长性状。由此证明,西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白PsnsLTP增加了转基因烟草抵御生物胁迫和非生物胁迫的能力,这些工作为深入研究PsnsLTP基因的抗逆机制提供了参考。

疫霉侵染的辣椒cDNA文库的构建及非特异性脂转移蛋白cDNA的筛选

建立了辣椒疫霉侵染的辣椒幼苗cDNA文库,该原始文库含有1.5×106个独立克隆,插入片段约为0.5-2 kb.采用基于PCR技术的96孔文库筛选方法,从该cDNA文库中筛选出了1个应答辣椒疫霉侵染的候选基因的全长cDNA.经生物信息学分析,推测这个候选基因为非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid-transfer protein,nsLTP)基因.

玉米非特异性脂转移蛋白的cDNA克隆和表达及表达产物的钙调素结合活性分析

用RT-PCR法克隆了成熟的玉米非特异性脂转移蛋白的cDNA,将它连接到表达质粒上并转化至大肠杆菌中表达。以钙调素凝胶覆盖法和钙调素亲和层析下拉实验对表达产物进行分析,证明它具有结合钙调素的活性,并且这种结合不依赖于Ca2+,与前期研究中钙调素结合蛋白-10和拟南芥非特异性脂转移蛋白1的结合特性相同。采用基因删除和缺失突变的方法研究玉米非特异性脂转移蛋白与钙调素结合的结构域,结果表明钙调素结合于47～60位氨基酸,预测的蛋白质二级结构为碱性双亲α-螺旋结构。

植物脂质转运蛋白的研究

植物脂质转运蛋白(Lipid transfer protein,LTP)是一类小分子碱性蛋白,占植物可溶性总蛋白的4%左右,目前已经在许多植物中克隆了LTP的编码基因。LTP是一种多功能的蛋白,除了被认为参与了磷脂在生物膜之间的运输外,LTP还在生物膜、角质和脂质的形成、植物的生殖发育以及信号的转导等生物过程中发挥了重要的作用,另外LTP作为一种食物过敏原和防御蛋白引起了科研人员越来越多的兴趣。本文综述了LTP的生物学功能,对LTP在农业上的应用前景做了展望。

水稻类非特异脂质转移蛋白OSDIR的表达和纯化

通过PCR方法从水稻(O ry za sa tiva)染色体基因组中扩增一个编码非特异性脂质转移蛋白(nonspec ific lip id transfer prote in,nsLTP)类似蛋白的基因(OSd ir),将该基因片段克隆到硫氧还蛋白融合表达载体pET 32a(+)中后,在BL 21(DE 3)trxB-宿主菌中实现了融合蛋白的高表达,表达产物为包涵体。利用尿素溶解包涵体并复性后,再通过Sepharose N i2+-che lating fast flow柱亲和纯化融合蛋白,得到重组O SD IR蛋白。

水稻脂质转移蛋白cDNA结构及相应肽链构造特征的分析

从水稻(Oryza sativa L.ssp.indica)“广陆矮4号”黄化苗cDNA库中分离到一个与其它植物脂质转移蛋白(LTP)基因同源性很高的cDNA克隆(pFDRSC144)。完成了pFDRSC144克隆中840bp插入片段全顺序的测定。结果表明,该片段包含354个碱基的编码区,编码118个氨基酸,其中包括26个氨基酸组成的信号肽。从疏/亲水性分布曲线可看出,该肽链形成的分子具有很大范围的疏水面。按Garnier二维结构预测法显示成熟蛋白的肽链主要以β-折叠肽链的形式存在,推测可能形成一种有利于脂质传送的开放性管形构造。Southern杂交分析表明,LTP基因在水稻基因组中以基因家族的形式存在。

口腔鳞癌转移与特异性核基质结合区结合蛋白质1(SATB1)表达的关系

目的：检测特异性核基质结合区结合蛋白质1在口腔鳞状细胞癌中的表达及其与浸润转移的关系。方法：采用免疫组织化学染色法及逆转录-聚合酶链反应检测SATB1在各组织中的表达。结果：52例口腔鳞癌原发灶中,SATB1蛋白在病理分级Ⅱ~Ⅲ级组（中~低分化鳞癌）表达明显高于Ⅰ级组（高分化鳞癌）（P〈0.05）;在临床分期Ⅲ~Ⅳ期组高于Ⅰ~Ⅱ期组（P〈0.05）。SATB1蛋白和mRNA的表达在16例淋巴结转移组高于36例无淋巴结转移组（P〈0.05）。SATB1mRNA的表达量在6例淋巴结转移灶高于16例转移组原发灶（P〈0.05）。结论：SATB1蛋白及SATB1mRNA在口腔鳞癌中的表达上调与口腔鳞癌的恶性程度及转移相关;SATB1可能在口腔鳞癌的发展、转移过程中起到促进的作用。

水稻黄化苗中2种脂质转移蛋白基因表达的比较研究

从水稻(Oryza satiua)“广陆矮4号”黄化苗cDNA文库中筛选到2种可能编码脂质转移蛋白(LTP)的cDNA克隆,将它们对应的基因命名为LTP110和LTP114.在完成2种cDNA全顺序测定的基础上,对它们的核苷酸顺序及推断的蛋白质一级结构进行了比较分析,结果显示两者均具有典型的LTP结构特征.Northern杂交结果表明,LTP110在幼叶和胚芽鞘中表达较强,在根中表达较弱;而LTP144只在幼叶中表达,在胚芽鞘和根中没有检测到信号.在黄化苗幼叶的生长过程中,LTP110的表达呈下降的趋势;而LTP144的表达则呈先升后降的趋势.显然两者具有不同的器官表达特异性和时间表达特异性,功能上可能有所不同.Southern杂交结果则显示,LTP110和LTP144均属于一个小的基因家族.

脂质微环境与肝癌侵袭转移关系的研究进展

脂质代谢异常与肝癌发生、发展密切相关,但很多机制尚不明确。本文通过综述脂质微环境与肝癌侵袭转移的联系,从脂肪因子、结合蛋白及免疫重编程3个方面深入探讨脂肪细胞和肝癌细胞复杂的相互作用,显示了肿瘤脂质微环境既从各个方面促进肝癌侵袭转移,又多角度地抑制肿瘤发展的复杂功能,基于这些理论进展及新的研究思路,以期为通过靶向干预肿瘤脂质微环境治疗肝癌提供理论依据。