正常与退变椎间盘纤维环细胞相关基因的差异表达

目的:研究人正常和退变椎间盘纤维环细胞椎间盘退变相关基因表达量的差异,探讨这些相关基因与椎间盘退变的关系,筛选明显差异基因作为退变纤维环细胞体外刺激因子,逆转椎间盘退变。方法:实时荧光定量PCR(real-time qRT-PCR,SYBR Green)技术检测人正常和退变纤维环细胞TGF-β、IGF-1、bFGF、IL-1、TIMP-1、COL1A1、BMP-14、PDGF、aggrecan、COL2A1、SOX 9、BMP-2、iNOS、EGF、MMP3、BMP-4和BMP-7mRNA表达水平。结果:与正常纤维环细胞相比,退变纤维环细胞TGF-β、IL-1、PDGF和IGF-1 mRNA表达量降低(P<0.01,P<0.05);bFGF、TIMP-1、BMP-14和COL1A1 mRNA表达升量高(P<0.01);正常纤维环细胞aggrecan和BMP-2 mRNA高表达,退变纤维环细胞两者表达阴性;COL2A1、iNOS和MMP3在正常纤维环细胞mR-NA有表达,在退变纤维环细胞表达阴性;EGF在正常纤维环细胞mRNA表达阴性,而在退变纤维环细胞有表达。Sox-9、BMP-4和BMP-7在正常和退变纤维环细胞mRNA表达均为阴性。结论:椎间盘纤维环退变与TGF-β、IL-1、PDGF、IGF-1、aggrecan和BMP-2 mRNA低表达,bFGF、TIMP-1、BMP-14和COL1A1 mRNA高表达相关;BMP-2、TGF-β、PDGF和IGF-1可作为退变纤维环细胞体外刺激因子,用于逆转椎间盘退变的研究;bFGF、TIMP-1和BMP-14可能是椎间盘纤维环细胞退变的标志物。

山羊椎间盘退变相关基因Sox9密码子偏爱性分析

为了明确Sox9基因密码子的使用特征,揭示山羊和其他物种Sox9基因的进化规律,为建立骨科腰椎间盘退变动物模型提供基础研究试验依据,此研究利用生物信息学软件CodonW、Usage Codon和DNAMAN分析山羊Sox9基因完全编码区密码子偏爱性,比较不同物种Sox9基因密码子偏爱指标,基于完整编码区序列生成了亲缘关系进化聚类图,计算出每个物种Sox9基因的总变异值。分析显示山羊Sox9基因中有26个偏好使用密码子以G/C为第三位碱基;夜猴、家犬、原鸡、大猩猩、人、恒河猴、小家鼠、家兔、绵羊、黑猩猩、婆罗洲猩猩和褐家鼠等12个物种在密码子使用上与山羊Sox9基因基本相似,但是在编码丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸等个别氨基酸时,原鸡和小家鼠及褐家鼠与其他物种的密码子偏爱性存在差异。Sox9基因偏好使用以G/C结尾的密码子。亲缘关系进化聚类图和不同物种RSCU值显示Sox9基因密码子偏好性与亲缘关系的远近存在关联性。

转基因逆转椎间盘退变重组腺病毒载体Ad/CMV-hTGFβ1的构建

目的 构建一个高效的重组腺病毒载体Ad/CMV-hTGFβ1,用于进一步的基因转移逆转椎间盘退变的实验研究。方法 应用一种新的重组腺病毒构建系统来构建腺病毒载体。首先将hTGFβ1的cD-NA亚克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV上。重组穿梭质粒pShuttle-CMV-hTGFβ经PmeI酶切线性化后,与超螺旋的病毒质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183。两种质粒在BJ5183中进行同源重组,重组病毒质粒pAd/CMV-hTGFβ1经卡那霉素平板筛选获得。经酶切分析鉴定后,重组病毒质粒用PacI酶切线化。线化的病毒质粒经脂质体转染293细胞(包装细胞系),于2周内收集重组病毒。结果 重组腺病毒质粒经BamHI,PacI酶切鉴定,在0.8％的琼脂糖凝胶电泳中出现了诊断性片段;感染的293细胞出现了明显的细胞病变效应(CPE);PCR产物电泳证实了重组病毒的存在;免疫组织化学染色证实了hTGF-β1在293细胞中的表达。结论 重组腺病毒载体Ad/CMV-hTGFβ1的获得以及目的基因表达的验证使下一步的逆转椎间盘退变的实验研究成为可能。