椰子花粉过敏原的分离、鉴定与纯化

目的对椰子花粉的变应原组分进行初步的分离、鉴定及纯化。方法提取椰子花粉粗提液,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离椰子花粉的蛋白质组分并测定其相对分子质量,采用免疫印迹法鉴定其变应原成分,并通过离子交换层析对椰子花粉变应原进行初步分离纯化,免疫印迹进行检测。结果SDS-PAGE显示椰子花粉粗提液有10条蛋白带,其中相对分子质量(Mr)为60 000、50 000、35 000、28 000、19 000、16 000和14 000的蛋白可与椰子花粉过敏性病人血清IgE结合,且Mr50 000、16 000和14 000为主要变应原;离子交换层析结果显示主要过敏原成分主要分布在Ⅴ峰中。结论对椰子花粉变应原进行了初步的分离、鉴定和纯化,为临床椰子花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础。

椰子花粉过敏原基因的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

目的:克隆并表达椰子花粉中泛变应原肌动蛋白抑制蛋白(Profilin)。方法:利用RT-PCR结合RACE技术克隆椰子花粉中泛变应原profilin的全长基因,并进行序列分析。然后设计带有酶切位点的特异性引物,采用RT-PCR获得整个椰子花粉profilin的开放阅读框,将其与pET28a载体连接并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,通过Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用Western blot检测其IgE结合活性。结果:克隆获得了椰子花粉profilin的全长基因,由608个碱基组成,开放阅读框为396个碱基(包括终止密码子),编码131个氨基酸。经分析,这个序列编码的蛋白为小分子量酸性蛋白,等电点为4.61,分子量约为14 kD。此序列已被GeneBank收录,登陆号为EF173598。重组椰子花粉profilin在大肠杆菌中高效的表达和纯化后,经Western blot检测具有良好的免疫学活性。结论:成功地克隆和表达了椰子花粉profilin,为该花粉profilin用于椰子花粉过敏诊断和免疫治疗提供了理论依据。

椰子花粉过敏原profilin蛋白体外重折叠过程的光谱学研究

在基因工程技术中,采用原核表达系统获得的重组蛋白通常都是以包涵体的形式存在。利用圆二色性光谱、荧光光谱和同步荧光光谱对尿素诱导的重组椰子花粉泛过敏原profilin蛋白包涵体的复性过程进行了系统的光谱学研究,得到了profilin蛋白复性过程的光谱学特征;结合生物信息学方法,通过对profilin蛋白的二级结构和三级结构的预测,进一步分析了复性过程中profilin蛋白构象变化的特点,初步建立了一种新的检测重组变应原蛋白复性程度的光谱学实验方法,为重组蛋白包涵体复性机理的深入研究进行了有益的探索。