基于体温扩增的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种3种可视化快速检测方法的建立

为实现食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)的快速检测,基于体温扩增技术——酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA),并根据唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种bonM基因序列设计和筛选了ERA检测引物和探针,分别建立ERA显色法、荧光法、试纸条法3种可视化快速检测方法,并评估其特异性和灵敏度,以及在市售样品检测适用性和准确性。结果显示,建立的方法对3株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均有扩增,其他常见的食源性致病菌以及其他唐菖蒲伯克霍尔德氏菌均无扩增,说明检测方法的特异性良好。3种方法的检出限均为10^(-2)ng/μL,灵敏度较好。采用建立的3种可视化快速检测方法对15份市售样品进行检测,检出阳性2份,检出率为13.3%。该结果与国标方法的检测结果一致,说明方法具有较好的适用性和准确性。本研究建立的基于体温扩增技术的显色法、荧光法和试纸条法具有较高的特异性及灵敏度,37℃体温扩增15 min左右即可获取检测结果,且裸眼可视,可为食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种的现场可视化快速筛查提供新型简便的策略。

云南省一例唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)食物中毒事件调查分析

目的调查分析云南省一例唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)食物中毒事件。方法参照GB/T4789.29-2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》对样品进行唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检测。按照GB 5009.189-2016《食品安全国家标准食品中米酵菌酸的测定》检测样品中的米酵菌酸,采用液相色谱法对样品进行检测。用VITEK 2COMPACT全自动微生物生化鉴定仪和飞行时间质谱进行微生物鉴定。结果2份样品鉴定结果为唐菖蒲伯克霍尔德菌。2份样品均检测出米酵菌酸,含量分别为18.0和24.2 mg/kg。结论本次食物中毒源于食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)污染。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种环介导等温扩增荧光方法的建立

【目的】建立一个基于环介导等温扩增与荧光探针结合的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种(Burkholderia gladioli pv.cocovenenans)特异性检测方法。【方法】通过多重序列比对分析,选择B.gladioli pv.cocovenenans共有的bonA为靶位点,设计环介导等温扩增的特异性引物和荧光探针,通过19株B.gladioli和3株非目标菌株,验证该方法的特异性。将该方法的检测特异性与现有的基于实时荧光定量PCR鉴定B.gladioli pv.cocovenenans的方法进行比较,并对建立的方法进行灵敏度探究。【结果】建立的环介导等温扩增荧光鉴定方法对B.gladioli pv.cocovenenans具有特异性,能在30 min内得出结果,且该方法能进行可视化直接观测。该方法的基因组DNA最低检测限度为1.98 pg/μL,检测灵敏度为2.7×102 CFU/mL。另外,该方法能应用到食品样品中B.gladioli pv.cocovenenans的检测。【结论】本研究建立了一个快速、可视化、特异性强的检测方法,能有效用于B.gladioli pv.cocovenenans的快速筛查,为保障食品安全提供了一种快速、准确的分子检测手段。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型实时荧光PCR方法的建立

目的:建立唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株(Burkholderia gladioli pv.cocovenenans)的实时荧光PCR方法。方法:根据唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病型菌株Co14的米酵菌酸生物合成基因bonM序列,用Primer Premier 6设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立了实时荧光PCR反应体系。通过对5株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株及14株其他菌株进行实时荧光PCR检测,验证该方法的特异性。同时从菌液浓度和DNA浓度水平上进行研究,确定该检测方法的灵敏度。并同时采用该方法和GB 4789.29—2020,对155粉湿米粉及其原料大米进行检测,验证该方法的实用性。结果:实时荧光PCR方法特异性检测结果显示,5株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均扩增阳性,其他菌株均扩增阴性。通过灵敏度试验,确定该方法检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株的菌液检测灵敏度为6.5×10^(2)cfu/mL,DNA检测灵敏度为4.8×10^(-4)ng/μL。实际样品的检测结果显示,采用该方法进行检测,2份湿米粉和3份大米PCR检测阳性,其余150份样品均为阴性,这与采用GB 4789.29—2020检测的结果一致,验证了该检测体系的实用性。结论:文章建立的实时荧光PCR检测方法,反应时间仅需1 h,设计的引物和探针具有较高的特异性及灵敏度,能够有效地用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株的快速筛查,这为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株的检测提供了一种简便、快速、准确的分子检测手段。

一种固氮菌-唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的表型特征

目的对与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌和椰毒伯克霍尔德氏菌有关的4株重要的菌株进行表型性状描述,以证明它们是同一个菌种。方法着重用传统的底物利用试验和GC及专用软件(Sherlock系统6.1)分析菌细胞的脂肪酸,做全面的表型描述。结果 4株菌的30项生化反应完全一致,170项底物利用试验95%一致,12种脂肪酸及脂肪酸组合基本一致;4株菌都是固氮菌。结论 4个株菌为同一个菌种,都可称为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。

米中椰毒假单胞菌酵米面亚种污染调查和风险分析

调查湿米粉和湿粉条生产原料米中米酵菌酸和唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的污染状况,并模拟湿米粉和湿粉条产品环境,对菌株的产毒特性进行研究。在广东省的湿米粉和湿粉条生产企业及小作坊,共采集大米、碎米等原料米158份,其中45份样品检出米酵菌酸,含量范围是0.838~8.260μg/kg。筛选到5株具有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特征的可疑菌株,经产毒和分子生物学验证,确定均为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)。5株菌的米酵菌酸产生能力差异较大,菌株Y2的米酵菌酸产生能力明显高于其他菌株,而且很容易在湿米粉和湿粉条样品中产生米酵菌酸,并且样品中含有大米比只有淀粉产生更高浓度的米酵菌酸。结果表明,湿米粉和湿粉条的原料米中均有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)和米酵菌酸污染的风险,需要加强对其生产过程中原料米的污染控制和风险监管。