楸灵素的萃取-反萃分离纯化方法研究

为了探索萃取-反萃分离纯化楸灵素的最佳条件,利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)研究了溶剂种类、溶剂与物料的体积比以及萃取体系的pH值对分离纯化效果的影响。结果表明楸灵素在4种有机溶剂中油水分配系数大小依次是:乙酸乙酯>氯仿>二氯甲烷>甲苯;酸萃取时萃取剂体积过小,楸灵素存在降解;萃取-反萃过程中,随着pH增大,楸灵素在油水两相中分配比值减小。在pH=4.5发酵液-乙酸乙酯1∶1和pH=9氢氧化钠-乙酸乙酯1∶3条件下进行萃取反萃取,楸灵素的萃取收率达78.28%,对应楸灵素色谱纯度97.7%。本研究显示通过加入酸碱,调节电离平衡,改变其极性和油水两相分配系数分离纯化楸灵素的方法工艺是可行的。

楸灵素在水环境下的热稳定性及热降解动力学

用高效液相色谱检测不同温度下楸灵素降解的动态变化。建立楸灵素热降解动力学模型,定量分析温度对楸灵素稳定性的影响。实验发现楸灵素在发酵液中的热降解符合一级反应动力学,热降解速率常数随温度提高而快速上升,符合Arrhenius方程。4℃条件下楸灵素在发酵液中的半衰期长达25 d,25℃条件下则缩短为6 d,而55℃条件则进一步下降到14 h。模型预测楸灵素在70℃半衰期只有3.7 h,楸灵素发酵液旋转蒸发会造成大量降解,收率低下,与验证实验结果完全吻合。

树脂对楸灵素吸附与洗脱特性的影响

以含有楸灵素的楸树内生真菌FSN002发酵液为原料,采用静态实验法考察树脂对楸灵素的吸附过程,建立树脂吸附动力学模型,并通过模型分析定量研究各种树脂对楸灵素吸附与洗脱特性的影响.结果表明,树脂对楸灵素的吸附过程符合一级动力学模型,其中反相树脂对楸灵素的最大吸附能力平均为39.39mg/mL,是离子交换树脂的1.38倍;反相树脂吸附的楸灵素不易洗脱,平均洗脱收率为12.2%,离子交换树脂的平均洗脱收率为46.6%,其中阴离子交换树脂D201的楸灵素洗脱收率最高达83.0%,吸附速率较快,综合性能较好.

利用紫外诱变选育楸灵素合成缺陷株

楸树内生真菌菌株FSN002次生代谢产物楸灵素具有优良的抗肝癌性能,选育突变株是研究楸灵素生物合成机制的重要手段。真菌孢子预培养13 h左右,萌发形成4–6个细胞的幼嫩菌丝,适合作为紫外诱变的出发材料。实验发现紫外光强度和照射时间对真菌致死率的影响符合线性模型,二者之间不存在明显的交互作用。当紫外光强度为90 000μJ/cm^2,时长为6 s时,真菌的致死率在95%左右。在上述优化选育诱变条件下,获得了1株楸灵素合成能力完全丧失的突变株和1株楸灵素合成能力下降到野生型16%的突变株,为下一步研究楸灵素的生物合成机制以及高效生产楸灵素奠定了基础。