横纹肌细胞培养液对鼻咽癌CNE2细胞生长抑制作用的实验研究

目的:通过研究横纹肌细胞(心肌和骨骼肌)培养液对人鼻咽癌细胞(CNE2)增殖的影响来观察横纹肌细胞微环境对肿瘤细胞生长的影响,探讨横纹肌内罕见转移瘤这一现象的发生机制。方法:采用酶解法原代培养新生W istar大鼠心肌细胞和骨骼肌细胞,根据取材部位、形态学和免疫酶染色方法检测横纹肌α-肌动蛋白进行细胞鉴定,采用免疫酶染色方法进行细胞纯度鉴定。原代培养的细胞达对数生长期后更换新鲜培养液,继续培养24小时后取上清液,用MTT法分析骨骼肌和心肌细胞培养液对CNE2的体外生长抑制作用。以顺铂为阳性对照,以DMEM为空白对照,同时以鼠正常肾小球系膜细胞(MCs)为CNE2的阴性对照,观察心肌细胞培养液、骨骼肌细胞培养液和顺铂对CNE2细胞增殖的作用。采用胰酶消化法,热灭活法初步探讨横纹肌细胞培养液的理化性质。结果:CNE2与CMCM、MMCM共同培养后,细胞存活率明显下降,与DMEM相比差异均具有显著性(P<0.05),而MCs细胞存活率无明显影响(P>0.05)。DDP对CNE2和MCs细胞均具有显著性抑制作用(P<0.05)。心肌细胞培养液和骨骼肌细胞培养液经胰酶消化后活性仍然存在(P<0.05),而经热灭活后活性消失(P>0.05)。结论:新生大鼠横纹肌细胞培养液对鼻咽癌细胞增殖有明显的抑制作用;而对正常细胞增殖无明显影响,与顺铂的抑制作用明显不同;由此推测横纹肌细胞培养液中有可能存在一种抑瘤物质,这可能是横纹肌罕见转移瘤的关键因素。

骨骼肌条件培养液对肺癌细胞生长抑制作用的实验研究

背景与目的:恶性肿瘤可转移至机体所有器官,但在骨骼肌中罕见。本实验拟通过研究骨骼肌微环境因素对不同转移潜能肺癌细胞增殖的影响,探讨骨骼肌内转移瘤罕见这一现象的发生机制。方法:原代培养新生Wistar大鼠骨骼肌细胞,用MTT法分析和比较骨胳肌细胞条件性上清液(murineskeletalmuscleconditionedmedium,MMCM)对不同转移潜能肺癌细胞的体外抑瘤作用,以阿霉素作为MMCM的阳性对照,以金黄地鼠肾细胞株BHK-21作为肺癌细胞的阴性对照。结果:不同转移潜能肺癌细胞,即人肺巨细胞癌低转移株PLA-801C和人肺巨细胞癌高转移株PLA-801D与MMCM共同培养后,PLA-801C细胞在MMCM稀释至50%时其生长增殖即不受明显影响,而PLA-801D细胞的生长在MMCM稀释至原液的6.25%时仍受显著抑制。而MMCM在各稀释浓度点对BHK-21细胞的生长均无显著抑制作用。结论:新生大鼠骨骼肌细胞上清液可选择性抑制恶性肿瘤细胞增殖;MMCM对人肺巨细胞癌高转移株较低转移株细胞的生长抑制作用更明显。

大鼠脑微血管内皮细胞条件培养液对皮层神经元活性的影响以及通络救脑注射液的干预作用

目的:探讨脑微血管内皮细胞条件培养液对神经元活性的影响,以及通络救脑注射液对此过程的干预作用。方法:制备正常、正常用药、拟缺血损伤、拟缺血损伤用药4种脑微血管内皮细胞条件培养液(N-CM、NT-CM、I-CM、IT-CM),分别作用于培养的皮层正常神经元和拟缺血损伤神经元,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测分析各个条件培养液对神经元活性的影响特征。结果:①N-CM对正常神经元无明显影响,但对拟缺血损伤的神经元表现出一定的保护作用,尤其是NT-CM可明显提高受损的神经元活性;②I-CM可降低正常神经元活性,对已受损的神经元则进一步加重损伤,IT-CM可明显改善这种损伤状态。结论:脑微血管内皮细胞的旁分泌作用可能在中枢系统缺血性损伤中起重要作用,有可能是不能透过血脑屏障的中药成分发挥治疗作用的靶点。

骨髓基质细胞条件培养液调节神经干细胞分化有效成分的蛋白质微阵列分析

目的检测骨髓基质细胞条件培养液(N-CM)中诱导神经干细胞(NSCs)向神经元方向分化的细胞因子,探讨骨髓基质细胞(BMSCs)调节NSCs分化的机制。方法将收集到的N-CM混匀后经超滤浓缩分为大于5kD和小于5kD两部分,用这两部分培养液分别培养NSCs,确定其中能促进NSCs分化为高比例神经元的部分并进行大鼠蛋白质微阵列检测。结果N-CM分子量大于5kD的部分可以促进NSCs分化为高比例神经元,并通过蛋白质微阵列检测,与单纯骨髓基质培养液相比,有7种细胞因子的表达量上调了1.5倍,分别是CINC-3、CNTF、IFN-γ、IL-1α、MCP-1、TIMP-1和VEGF。结论BMSCs分泌的可溶性分子对NSCs分化为神经元有促进作用,其中某些分子量大于5KD的细胞因子可能在这一调节作用中发挥效应。

周细胞条件培养液对视网膜色素上皮细胞、胶质细胞及巨噬细胞增殖的影响

目的观察体外培养的视网膜周细胞条件培养液对视网膜色素上皮细胞、巨噬细胞及胶质细胞生长的影响。方法MTT法测定不同稀释度的周细胞条件培养液对色素上皮细胞、巨噬细胞及胶质细胞生长的影响。结果随着周细胞条件培养液稀释度的增加,其对上述细胞的抑制生长作用亦越明显。结论周细胞的缺失将导致色素细胞、巨噬细胞及胶质细胞的增殖,细胞间相互作用对于糖尿病视网膜病变的发生和发展是非常重要的。

肝癌细胞条件培养液诱导新生儿脐带血贴壁细胞的转化

背景与目的:脐带血干细胞为早期未分化细胞,对外界环境的影响十分敏感,在致癌因素作用下脐带血干细胞可能发生恶性转化。本研究旨在探讨脐带血干细胞对致癌因子的敏感性。方法:应用淋巴细胞分离液从新生儿脐带血中分离出有核细胞后进行细胞培养,当细胞贴壁后,应用含有10%HepG2肝癌细胞条件培养液的培养液继续培养,获得了一个新的细胞系,将其命名为H-UCB。应用电镜、流式细胞仪和Westernblot等检测其特征,应用软琼脂实验检测其克隆形成率。结果:在培养到第三代以后H-UCB细胞增殖能力明显增强。形态学观察显示,细胞形态呈成纤维细胞样和肝细胞样,核浆比例增大。电镜观察,细胞表面有较多微绒毛,核大并且形态不规则,胞浆内有空泡,有胞吞胞饮现象。染色体分析显示,细胞的染色体众数在50～70条之间,为异倍体。流式细胞仪检测显示,细胞增殖周期为22.9h,染色体数目为二倍体和四倍体之间。Westernblot检测结果显示,c-Myc蛋白、核增殖相关蛋白(PCNA)的表达水平较高。经免疫荧光染色后进行流式细胞仪检测,显示H-UCB细胞表面标志物CD105、CD34、CD106阳性率分别为79.0%、1.2%、12.2%,而对照组HepG2细胞的CD105、CD34、CD106的阳性反应率分别为15.0%、9.8%、1.4%。软琼脂克隆形成率为(13.2±2.6)%。结论:从新生儿脐带血分离获得的有核细胞在肝癌细胞条件培养液作用下发生了恶性转化,具有肿瘤细胞的特征,属内皮细胞来源。

蜕膜细胞条件培养液对滋养细胞侵袭调节基因表达的影响

目的 探讨蜕膜细胞条件培养液（DCM）对滋养细胞侵袭调节基因表达的影响。方法 用体外培养早孕、晚孕蜕膜细胞的方法制备DCM,然后将其处理体外培养的早孕滋养细胞。用半定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分析早孕滋养细胞侵袭调节基因表达的变化。结果 正常培养的早孕滋养细胞中基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、基质金属蛋白酶抑制物（TIMP-1）、尿激酶型纤溶酶原激活因子（u-PA）mRNA均有表达;而TIMP-2、纤溶酶原激活因子抑制因子（PAI-1）mRNA未见表达。早孕和晚孕DCM均能下调滋养细胞MMP-2、MMP-9、u-PAmRNA的表达,而上调TIMP-1mRNA的表达。早孕、晚孕DCM均能诱导滋养细胞PAI-1mRNA的表达,但对TIMP-2mRNA的表达未见有影响。结论 蜕膜细胞可能通过调节滋养细胞中MMP-2、MMP-9与TIMP-1之间的平衡以及u-PA与PAI-1之间的平衡,而影响滋养细胞的侵袭能力。

人毛乳头细胞条件培养液治疗女性脱发的临床疗效观察

目的:观察人毛乳头细胞条件培养液皮下注射治疗女性脱发的临床疗效。方法:用人毛乳头细胞条件培养液皮下注射18例女性脱发患者的脱发区,每周1次,共4次。结果:人毛乳头细胞条件培养液治疗过的女性脱发区,可见到重新生长的毳毛和终毛。结论:人毛乳头细胞条件培养液对女性脱发患者有明显的治疗作用。

心肌细胞条件培养液对鼻咽癌细胞生长抑制作用体外实验研究

[目的]探讨心肌微环境因素对高转移潜能鼻咽癌细胞的影响。[方法]原代培养新生Wistar大鼠心肌细胞,用MTT法比较心肌细胞条件性上清液(CMCM)对高转移潜能鼻咽癌细胞的体外抑制作用。以顺铂作为CMCM的阳性对照,以正常细胞鼠肾小球系膜细胞作为鼻咽癌细胞的阴性对照。[结果]鼻咽癌细胞与不同浓度的CMCM共同培养后,细胞存活率明显下降(P<0.05),而对正常细胞鼠肾小球系膜细胞存活率无明显影响(P>0.05)。[结论]新生大鼠心肌细胞条件培养液可选择性地抑制鼻咽癌细胞的增殖。

间充质干细胞条件培养液对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和黏附的影响

本研究探索间充质干细胞(MSC)条件培养液对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和黏附能力的影响及其可能的机制。采用经典全骨髓贴壁法培养MSC,用流式细胞术鉴定MSC表面标志特征。收集MSC条件培养液(MSC-CM),过表达基质细胞细胞衍生因子1(SDF-1)的MSC条件培养液(Ad-SDF-1-MSC-CM),以2%FBS-DMEM、15%FBS-DMEM培养液为对照,将MSC-CM、Ad-SDF-1-MSC-CM等条件培养液加入人脐静脉内皮细胞株(CRL1730)作用24 h后,用MTT法检测CRL1730细胞的增殖情况,利用划痕法和黏附模型评价MSC-CM对CRL1730细胞迁移能力和黏附能力的影响。结果表明,与MSC-CM相比,Ad-SDF-1-MSC-CM处理的CRL1730细胞表现出更强的增殖能力,加入阻断剂AMD3100后,MSC-CM所介导的促增殖效应明显降低。MSC-CM、Ad-SDF-1-MSC-CM促进CRL1730细胞的迁移,AMD3100明显抑制其所介导的CRL1730细胞迁移。与MSC-CM相比,Ad-SDF-1-MSC-CM处理的CRL1730细胞黏附能力明显增强,AMD3100能显著降低其增强CRL1730黏附能力的作用。结论:MSC-CM对CRL1730细胞的促增殖、迁移和黏附能力与其分泌的细胞因子SDF-1密切相关。

骨髓成纤维细胞条件培养液对体外巨核系细胞生成的促进作用

目的 :探讨骨髓成纤维细胞条件培养液对体外巨核系细胞生成的促进作用。方法 :制备骨髓成纤维细胞条件培养液 (bonemarrowfibroblastsconditionedmedium ,BMF CM) ,分别观察BMF CM或BMF CM联合IL 11对体外培养条件下成熟巨核细胞生成的影响及BMF CM对巨核系祖细胞生成的影响 ,并用RT PCR的方法检测Meg 0 1人巨核细胞系细胞NF E2mRNA的表达。结果 :BMF CM促进成熟巨核细胞生成。BMF CM联合IL 11促进成熟巨核细胞生成的效果更佳。BMF CM能促进巨核系祖细胞的生成。将 30 %BMF CM加入Meg 0 1人巨核细胞系培养体系培养 4h ,与对照组相比 ,NF E2表达增强。结论

条件培养液对兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响

目的 :观察条件培养液对兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响。 方法 :分离兔骨髓 ,培养骨髓基质细胞 ,传代细胞分别用标准培养液和加入 β 甘油磷酸钠 ,地塞米松和抗坏血酸制成的条件培养液培养 ,观察不同培养液下骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素含量。 结果 :在条件培养液下 ,骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素含量明显高于标准培养液下的含量。 结论

ERK1/2信号转导通路对骨髓基质细胞条件培养液诱导大鼠中脑神经干细胞分化作用的影响

目的:探讨ERK1/2信号转导通路在骨髓基质细胞条件培养液(BMSCs-CM)诱导大鼠中脑神经干细胞(NSCs)分化中的作用。方法:将神经干细胞球种植干预先包被多聚赖氨酸的35 mm的培养皿中.神经干细胞球约30 min后贴壁.自然分化组将培养液换为含2%B27的neurobasal培养液,对照组换为BMSCs-CM.抑制剂组将培养液换为含有信号转导通路抑制剂PD98059(5μmol/L)的BMSCs-CM.7 d后采用免疫荧光染色方法观察NSCs后代细胞中神经元和星形胶质细胞的数量比例与形态差别。结果:用成年大鼠BMSCs-CM体外培养新生大鼠中脑NSCs.自然分化组NSCs分化的神经元为(15.7±10.3)%[低干对照组的(51.17±10.30)%.P<0.05],星形胶质细胞为(66.9±14.8)%[明显高于对照组的(23.26±5.60)%.P<0.05]。而抑制剂组神经元所占比例为(39.48±7.29)%[明显低于对照组.P<0.01].星形胶质细胞的比例为(31.01±8.96)%[明显高干对照组,P<0.01]。结论:BMSCs-CM可以提高神经干细胞分化为神经元的比例.并且同时降低了其分化为星形胶质细胞的比例,这两种作用很可能是通过ERK1/2信号转导通路实现的。

骨髓内皮细胞无血清条件培养液对骨髓内皮细胞增殖的促进作用

本文通过制备小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液(serum-free murine bone marrow endothelial cell conditioned medium, mBMEC-CM),经超滤分为分子量>10 kDa组分和<10 kDa组分,分别观察mBMEC-CM原液及其组分以及外源性细胞因子对小鼠骨髓内皮细胞集落生成的影响。用Wright’S Giemsa染色计数内皮细胞集落及检测骨髓内皮细胞的vWF,通过[3H]- TdR掺入量,观察mBMEC-CM原液及其组分以及外源性细胞因子对小鼠骨髓内皮细胞增殖的影响,并用分子杂交方法检测内皮细胞表达的细胞因子,从几个方面来研究mBMEC-CM对骨髓内皮细胞增殖的作用。结果显示,骨髓内皮细胞vWF 检测阳性。mBMEC-CM原液及其分子量>10 kDa组分能刺激骨髓内皮细胞集落增殖,且能明显增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR 掺入量;分子量<10 kDa组分对骨髓内皮细胞集落增殖无明显刺激作用,也不能增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR掺入量。外源加入IL-6、IL-11、SCF、GM-CSF、VEGF、bFGF 6种细胞因子能明显刺激骨髓内皮细胞集落增殖,SCF、VEGF、bFGF能明显增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR掺入量。Atlas array膜杂交实验显示骨髓内皮细胞内源性表达GM-CSF、SCF、MSP-1、endothelin-2、thymosin β10、connective tissue GF、PDGF-A chain、MIP-2α、PlGF、neutrophil activating protein ENA-78、INF-γ、IL-1、IL-6、IL-13、IL-11、inhibin-α等细胞因子的mRNA。上述结果提示,骨髓内皮细胞无血清条件培养液对骨髓内皮细胞增殖具有促进作用。

激活的星形胶质细胞条件培养液致痫效应及其对大鼠脑内Glu和IL-2R表达的影响

目的探讨激活的星形胶质细胞条件培养液(astrocytic conditioned medium,ACM)的致痫效应及其对脑内谷氨酸(Glu)和白细胞介素-2受体(interleukin-2recepter,IL-2R)表达的影响。方法本研究通过体外分离纯化培养,获取大鼠大脑皮质星形胶质细胞(Ast),用睫状神经营养因子(cliary neurotrophic factor,CNTF)激活Ast,取其培养液。将大鼠随机分为2组:A组(生理盐水对照组)和B组(ACM组)。对大鼠行侧脑室注射相应试剂后,观察并记录大鼠行为,采用免疫组织化学方法检测海马及大脑皮质内Glu的含量及IL-2R的表达变化。结果大鼠在侧脑室注射ACM后,有痫样发作,程度达III-IV级。免疫组化染色显示,在注药后2h,该组的海马区及大脑皮质内Glu、IL-2R免疫应答阳性神经元均较对照组明显增多,免疫应答增强,有显著性差异(P<0.05)。结论星形胶质细胞激活后,其释放物有明显的致痫效应,其机制与促进脑内Glu和IL-2R表达有密切关系。

不同状态的大鼠星形胶质细胞条件培养液对脑微血管内皮细胞血脑屏障特征性酶的影响

目的:探讨不同状态下大鼠星形胶质细胞(AS)条件培养液对脑微血管内皮细胞(BMEC)活性和血脑屏障特征性酶的影响,以及通络救脑注射液对此过程的干预作用。方法:收集正常、激活、激活合并通络救脑注射液处理、损伤、损伤合并通络救脑注射液处理5种不同状态的星形胶质细胞条件培养液,分别作用于拟缺血损伤的脑微血管内皮细胞,采用MTT法检测细胞活性,微量酶标仪法和上机比色法检测碱性磷酸酶(AKP)、γ-谷氨酰胺转肽酶(γ-GT)的活性。结果:正常星形胶质细胞条件培养液能明显提高受损内皮细胞活性,诱导AKP、γ-GT活性增强,激活的星形胶质细胞条件培养液上述作用下降,而损伤后的星胶条件培养液对受损内皮细胞几乎无作用。通络救脑注射液作用于激活和损伤星形胶质细胞后,其条件培养液提高内皮细胞活性和AKP、γ-GT活性的作用显著增强。结论:正常AS的分泌产物对提高BMEC的活性和维持血脑屏障特性具有重要意义,AS受损后,该作用减弱或消失,通络救脑注射液可显著提高AS对受损BMEC活性和功能的保护作用,这可能是该药物发挥脑缺血性损伤后血脑屏障稳定作用的内在机制之一。

通络救脑注射液对大鼠脑微血管内皮细胞活性及其条件培养液影响的初步研究

目的:观察通络救脑注射液对正常及拟缺血大鼠脑微血管内皮细胞的活性影响,并初步探讨细胞条件培养液内蛋白分泌的时效特征、奠定可溶性蛋白深入分析的技术基础。方法:通络救脑注射液作用于正常及拟缺血脑微血管内皮细胞之后,用MTS/PMS比色分析法测定细胞的活性,Bradford法测定细胞培养液总蛋白含量,比色分析法测定细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)漏出值,同步观察了5个时间点的细胞活性及条件培养液总蛋白量及LDH释放量。结果:通络救脑注射液能够提高拟缺血细胞的活性,且抑制LDH释放量;正常组分泌总蛋白量3h达到高峰,此时细胞活性最佳,LDH释放量亦少。拟缺血组分泌总蛋白量是6h达到高峰,此时LDH释放量最少,但细胞活性与3h比较有所下降。结论:通络救脑注射液对拟缺血细胞损伤具有保护作用;以3h至6h的细胞条件培养液做为收集目标是研究条件培养液的最佳时间段。

人毛乳头细胞条件培养液对斑秃患者的治疗作用

目的:观察人毛乳头细胞(DPC)条件培养液对斑秃患者的治疗作用,探讨DPC分泌促进毛囊生长的活性物质。方法:收集体外培养低传代DPC培养上清,制成冻干粉,用于治疗50例斑秃患者,并分别选择其中26例和10例作去炎松组和空白组自身对照。结果:DPC条件培养液组、去炎松组和空白组治愈率分别为74%、54%、10%,有效率分别为96%、73%、30%,DPC条件培养液组其治愈率和有效率均明显高于去炎松组和空白组(P<0.01)。结论:人DPC条件培养液有促进斑秃患者毛囊生长的作用。

发育期牙根端复合体细胞条件培养液对脂肪干细胞增殖、分化的影响

目的:初步探讨发育期根端复合体(developing apical complex,DAC)条件培养基(DAC conditioned medium,DACCM)对脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells,ADSCs)增殖和分化的影响。方法:取出生20 d SD大鼠分离其下颌磨牙DAC,并采用组织块联合酶消化法培养DAC细胞;经HE、免疫组化染色鉴定DAC后,收集原代培养的DAC细胞上清,分别用过滤和不过滤的方式制备不同条件培养基并用其对ADSCs进行培养;分别于培养3、5、7 d各时间点,MTT法检测ADSCs增殖能力;用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒及反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ADSCs的ALP蛋白活性及其基因的表达水平。结果:免疫组化染色显示,培养的DAC细胞CK-14、vimentin均为阳性表达;DACCM-未滤培养组ADSCs的增殖活性、ALP蛋白活性以及ALP基因表达水平均高于单纯α-MEM培养组和DACCM-过滤培养组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:不经过滤的DAC细胞上清制备的条件培养基对ADSCs增殖、分化的促进作用更明显。