磷酸化组蛋白H3--检测心肌细胞有丝分裂指数的可靠指标

目的采用磷酸化组蛋白H3鉴定心肌细胞有丝分裂,为研究心肌细胞增殖机制奠定形态学基础。方法对H9c2(2-1)大鼠心肌细胞进行培养,利用免疫荧光双重染色技术,用横纹肌肌动蛋白IgM单克隆抗体标记心肌细胞,用磷酸化组蛋白H3 IgG单克隆抗体标记有丝分裂的染色体,同时用Hochest 33342显示细胞核,荧光显微镜观察并摄片。结果心肌细胞胞质呈红色荧光,有丝分裂的染色体呈现不同形状的绿色荧光,胞核为蓝色。结论磷酸化组蛋白H3是观察和鉴别心肌细胞有丝分裂的可靠指标。

SPEG基因与扩张型心肌病相关性研究进展

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是心肌病中最常见的一种类型,临床上极易出现进行性心力衰竭和并发多种心律失常,治疗效果未能满足患者期望,预后不佳。目前DCM的病因尚不完全明确,目前可分为原发性DCM和继发性DCM,原发性DCM主要以家族性DCM多见,基因突变被认为是最主要致病因素,近年来与DCM相关的基因被发现及报道,其中SPEG基因的异常表达对DCM的致病有着重要意义,并主要以调节钙失衡机制致心肌细胞纤维化影响DCM的发生发展。

成年心肌梗死小鼠心肌细胞去分化现象观察

目的观察成年心肌梗死小鼠心肌细胞是否存在去分化现象。方法 20只成年小鼠随机分为观察组和对照组各10只,观察组制备心肌梗死模型,对照组仅行假手术处理。采用RT-PCR法检测两组心肌组织α-横纹肌肌动蛋白(α-SA)、横纹肌蛋白(α-actinin)、转录因子nkx2.5、肌细胞增强因子2(mef2)、细胞增殖核抗原(Ki67)、干细胞标记物血管内皮生长因子受体(flk-1)mRNA,采用免疫荧光染色法检测两组心肌组织磷酸化组蛋白(PH3)、连接蛋白43(cx43)。结果观察组心肌组织α-SA、α-actinin、nkx2.5、mef2 mRNA表达量均低于对照组,Ki67、flk-1、mRNA表达量及PH3、cx43均高于对照组,P均<0.05,结论成年心肌梗死小鼠心肌细胞存在去分化现象。

肌腱切断后骨骼肌的退变与再生

以纯系ＢＡＬＢ／Ｃ小白鼠１５只为实验动物，切断一侧腓肠肌肌腱。通过光镜、电镜及横纹肌肌动蛋白（ＭＡ）、肌红蛋白（ＭＧ）免疫组织化学染色等方法，观察切断肌腱后不同时间腓肠肌的形态改变，横纹肌特异蛋白表达的变化。结果发现：切断肌腱后１，２和４周均有肌纤维退变，再生成肌细胞移入退变的肌纤维。肌动蛋白和肌红蛋白的分布发生变化，到４周时肌红蛋白染色肌纤维全部为阳性，失去红白肌纤维型别差异。因此，肌腱切断后一方面肌纤维内部结构紊乱，另一方面存在持续的退变和再生反应，再生的肌细胞与原肌纤维融合。

小鼠胚胎心流出道近段心室化形成右心室小梁部

目的：探讨小鼠胚胎心流出道快速缩短及右心室形成机制。方法用抗α-横纹肌肌动蛋白（ SCA）、抗肌球蛋白重链（ MHC）抗体标记心肌，抗GATA-4抗体标记心肌及其前体细胞，抗α-平滑肌肌动蛋白（ SMA）抗体标记早期心肌细胞，抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体显示增殖细胞，抗人／鼠活性Caspase-3（CAS-3）抗体检测凋亡早期细胞，对胚龄9d（ E9）～E12（不同胚龄胚胎各取3～5只）小鼠胚胎心连续切片行免疫组织化学染色。结果E11时动脉囊及流出道远端心肌界退却至心包腔内，GATA-4、SCA、SMA染色示第二生心区前体细胞不断分化为心肌细胞添加在心动脉端使流出道延长。小鼠胚胎心流出道于E12缩短，缩短前及缩短过程中全长未检测到CAS-3阳性细胞。 E10～12时右心室及流出道近段心肌不断增生形成小梁并侵入邻近的流出道嵴内，流出道近端嵴逐渐小梁状心肌化改建为右心室壁；E12时近段间充质性流出道嵴内出现散在的SCA、SMA阳性心肌细胞及与流出道心肌相延续的SCA、SMA弱阳性心肌细胞流，这些结果表明近段流出道心肌小梁化、流出道嵴小梁状肌化形成了右心室小梁部。结论小鼠胚胎流出道近段心室化致右心室小梁部形成及流出道快速缩短，心肌细胞凋亡及转分化对流出道快速缩短的作用甚微。

大鼠生后不同发育阶段心肌细胞有丝分裂指数检测

目的检测大鼠生后不同发育阶段心肌细胞的有丝分裂指数,为研究心肌细胞增殖机制奠定形态学基础。方法取大鼠生后不同发育阶段心肌组织行冰冻切片,采用免疫荧光双重染色方法,以横纹肌肌动蛋白单克隆抗体标记心肌细胞,以磷酸化组蛋白H3单克隆抗体标记有丝分裂的染色体,同时用Hochest33342显示细胞核,荧光显微镜观察并拍照。结果心肌细胞胞质呈红色荧光,有丝分裂的染色体呈现不同形状的绿色荧光,胞核为蓝色;大鼠生后零天心肌细胞有丝分裂指数(0.905±0.087%)是生后2w(0.372±0.094%)的2.4倍(P<0.01),4w至成年几乎为零。结论大鼠出生2w后心肌细胞逐渐丧失增殖能力,由增生性生长向肥大性生长转化。

人胚心静脉窦和传导系统的早期发育

目的探讨早期人胚心静脉窦及传导系的发生发育机制。方法用抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗α-横纹肌肌动蛋白（-αSCA）和抗结蛋白（DES）抗体对29例C10~C16期人胚心连续切片行免疫组织化学染色。结果人胚发育C12~C13期,系统静脉汇集形成的静脉窦出现于心包腔尾端原始横膈间充质中,静脉窦壁间充质细胞逐渐分化为-αSCA阳性的静脉窦心肌细胞。C14期,心包腔的扩张使静脉窦进入心包腔内,参与了右心房的形成。DES阳性传导系心肌的分化始于C10期心房室管右侧壁,随发育逐渐向室间沟心肌扩展,发育为房室传导系的希氏束、左右束支及心室腔面的小梁心肌。在心房,DES表达首先出现于C11期心房背侧壁,在C13期,可见静脉窦左背侧壁-αSCA、-αSMA、DES阳性心肌带与左心房底部、房室管背侧壁相延续,这条心肌带可能参与了人胚心静脉窦至房室管传导系的发育。C14~C16期,DES强阳性染色从窦房结经左、右静脉瓣及心房的背、腹侧壁延伸至房室管右侧壁,可能是原始的心房传导通路。结论心包腔尾端原始横膈间充质是人胚静脉窦心肌发生区,原始横膈间充质细胞逐渐分化为心肌细胞,添加到人胚心管静脉端,形成心静脉窦心肌。人胚心传导系...

体外纯化后和诱导后骨髓间充质干细胞与骨髓单个核细胞移植治疗心肌梗死的效果比较

目的:将骨髓单个核细胞、体外培养纯化后及诱导后的骨髓间充质干细胞注射至大鼠心肌梗死区域,观察移植细胞的增殖及分化情况,分析其对缺血心肌细胞修复重建能力与心功能改善的影响。方法:实验于2005-07/2006-04在安徽省干细胞研究和治疗中心完成。取清洁级健康雄性新西兰白兔40只,按随机数字表法分为4组:骨髓间充质干细胞组、5-杂氮胞苷诱导组、骨髓单个核细胞组、对照组,10只/组。均于左心耳下缘结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,心电图出现S-T段弓背样抬高认为结扎成功。2周后骨髓间充质干细胞组注射第3代自体骨髓间充质干细胞1×106个,5-杂氮胞苷诱导组注射经5-杂氮胞苷诱导24h的第3代自体骨髓间充质干细胞1×106个,骨髓单个核细胞组注射骨髓单个核细胞2.5×107个/400μL,对照组仅注射400μL L-DMEM培养基。分别在术前、移植前、移植后2,4周应用超声心动图评价心脏功能,同时利用心肌声学造影观察缺血区的血流灌注情况。细胞移植后8周采用免疫荧光检测移植细胞在梗死区的生长状况,苏木精-伊红染色于普通显微镜下记数梗死区毛细血管密度。结果:骨髓间充质干细胞组9只、5-杂氮胞苷诱导组9只、骨髓单个核细胞组10只、对照组6只进入结果分析,其余动物因造模死亡未能完成整个实验。①超声心动检查发现术前、细胞移植前4组左室射血分数、左室短轴短缩率组间比较差异不显著;与对照组相比,细胞移植后2,4周骨髓间充质干细胞组和5-杂氮胞苷诱导组左室射血分数、左室短轴短缩率明显升高[对照组:(60.4±5.1)%,(62.4±7.8)%;(28.8±1.4)%,(27.2±5.3)%;骨髓间充质干细胞组:(70.8±4.6)%,(70.4±6.1)%;(33.8±3.4)%,(33.9±3.5)%;5-杂氮胞苷诱导组:(71.7±6.8)%,(70.3±5.8)%;(34.7±5.7)%,(35.5±6.3)%,P<0.05];左室收缩末内径、左室舒张末内径细胞移植组与对照组相比,差异不显著;心肌声学造影见细胞移植后心肌梗死区血流灌注改善明显。②细胞移植术后8周,所有细胞移植组均见Dil阳性移植细胞存活,并表达α横纹肌肌动蛋白和结蛋白。5-杂氮胞苷诱导组Dil阳性细胞出现具有典型横纹和肌小节样结构的心肌样细胞,各细胞移植组毛细血管密度均较对照组明显增多[(38.6±7.6)/mm2,(32.9±5.7)/mm2,(38.5±2.0)/mm2,(21.4±3.9)/mm2,P<0.05],各移植组间差异不显著。结论:①体外纯化培养与经5-杂氮胞苷诱导24h的骨髓间充质干细胞,以及新鲜分离的骨髓单个核细胞自体移植8周后均存活于梗死心肌中,并表达心肌细胞特异性标志α横纹肌肌动蛋白和结蛋白,移植后可明显改善左室收缩功能,增加毛细血管密度,改善局部血流灌注。②5-杂氮胞苷有助于促进骨髓间充质干细胞在体内向心肌细胞的分化成熟。

多种细胞移植治疗心肌梗死的比较

目的通过横向比较乳鼠心肌细胞、骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞及诱导后的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的疗效,确定更优异的移植细胞。方法分离培养和鉴定新生心肌细胞、骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞,并在体外用5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。二脒苯基吲哚(DAPI)标记移植细胞,5组(包括4组细胞处理组和对照组)大鼠急性心肌梗死后一周,可直视下在梗死中央区和周边区注射同等数量级细胞(2×106／只),4周后行心功能检测。处死动物,免疫荧光法检测移植细胞缝隙连接蛋白(connexin-43)、横纹肌肌动蛋白、血管平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅷ因子相关抗原(vWF)以确定移植细胞的分化情况,免疫组化法检测心肌组织中血管平滑肌肌动蛋白和vD因子相关抗原以确定血管新生情况。结果体外实验显示经5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞能部分表达横纹肌肌动蛋白:体内试验,移植4周后,间充质干细胞组、乳鼠心肌细胞组、骨髓单个核细胞组大鼠心功能均较对照组大鼠心功能明显提高,其中间充质干细胞组优于其他处理组,间充质干细胞,能表达血管平滑肌肌动蛋白,促进血管新生,但未见其表达心肌细胞特异抗原,而诱导后骨髓间充质干细胞对心功能无显著作用。结论在乳鼠心肌细胞、骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞、诱导后的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠的急性心肌梗死的比较中,间充质干细胞对心功能的保护效果最显著,其机制与血管新生等有关。

体外诱导兔骨髓基质细胞向心肌样细胞方向分化

目的：用兔骨髓基质细胞体外由5-氮胞苷诱导，使其定向分化，以获取心肌样细胞。方法：抽取兔骨髓后，体外培养、传代得到骨髓基质细胞，用5-氮胞苷(5-azacytidine)诱导24h，继续培养10天后，行免疫组织化学和RT-PCR鉴定。结果：诱导后部分细胞出现形态学改变，心肌特异性肌钙蛋T(cardiac isoform of Tropnin T,cTnT)、α横纹肌肌动蛋白(α-Sarcomericactin)免疫组织化学染色阳性。RT-PCR表明诱导后细胞表达心肌特异性β肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain)。讨论：骨髓间质细胞在体外5-氮胞苷诱导下部分可向心肌细胞方向分化，但分化的阳性率还不高，需要进一步研究。

催产素诱导下ES源性心肌样细胞与原代小鼠心肌细胞特性比较研究

目的研究催产素诱导下的胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)源性心肌样细胞与原代小鼠心肌细胞在生理学特性及标志物表达上的差异。方法 ES细胞(S6)经复苏、传代,在体外经催产素诱导下向心肌细胞分化,诱导后第10天,分化细胞经心肌标志物α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、肌钙蛋白T(cTnT)细胞免疫荧光学染色后,荧光显微镜及光镜下观察其细胞形态和染色结果;通过Western bolt方法分析α-sarcomeric actin、cTnT、心钠素(atrial natriuretic factor,ANF)的表达情况;在电镜下观察分化细胞及小鼠原代心肌细胞的特异性结构,比较分化细胞与原代小鼠各项指标的差异。结果催产素诱导的胚胎干细胞源性心肌样细胞cTnT、α-横纹肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性,ANF、cTnT、α-横纹肌肌动蛋白表达两组比较均无明显差异(P>0.05);电镜下观察ES源性心肌样细胞可见排列整齐的肌原纤维、肌小节结构和Z带、以及缝隙连接、桥粒连接。结论催产素诱导下ES源性心肌样细胞与原代小鼠心肌细胞在标志物表达及生理学特性上无明显差异。

突变基因在扩张型心肌病中作用的研究进展

扩张型心肌病(DCM)的病死率极高,发病后病情以不可逆方向快速进展。目前DCM仍没有远期缓解的治疗方案,但基因治疗逐渐成为未来DCM治疗的主要手段。因此,明确DCM致病相关突变基因的分子生物学机制成为DCM研究的重点。本文针对DCM致病相关基因突变的研究进展进行综述。

骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为心肌细胞的可行性,建立一种以干细胞移植为主治疗心肌梗死的治疗策略。方法 利用Percoll分离骨髓细胞培养获得MSCs;用5 氮杂胞苷(0.1、1、5、10、5 0和10 0 μmol/L)定向诱导2 4h,分别在诱导培养的第14d和2 1d ,检测细胞中的α-横纹肌肌动蛋白表达。将培养的MSCs,移植于急性梗死心肌组织内,4周后进行组织学和免疫组织化学染色,并用超声检测室壁运动和心功能改变。结果 骨髓间充质干细胞经5 氮杂胞苷诱导,培养2 1d后,5和10 μmol/L 5 氮杂胞苷诱导后的MSCs有一部分细胞表达α-横纹肌肌动蛋白,并一些细胞自发性跳动;细胞移植4周后,在缺血心肌有一部分MSCs与宿主心肌细胞形成连接并分化为具有典型的肌小节和表达α-横纹肌肌动蛋白阳性的心肌细胞。