樱桃小果病毒1号胶体金免疫层析试纸的研发与应用

近年来,病毒病在甜樱桃主产区的发生呈上升趋势,制约了甜樱桃产业升级和发展。能够侵染甜樱桃的病毒种类中,樱桃小果病毒1号(little cherry virus 1,LChV-1)导致樱桃果实缩小,彻底丧失经济价值,对甜樱桃产量影响较大。LChV-1通常具有潜伏侵染的特性,在樱桃苗期难以通过症状进行判断。同时,多数品种对LChV-1敏感,因此该病毒的早期检测对甜樱桃的生产尤为重要。传统的病毒检测手段需要专业仪器,不能满足田间快速检测的需求。本研究获取了LChV-1外壳蛋白的多克隆抗体,并研发了一种能够准确检测LChV-1病毒的胶体金免疫层析试纸,确定了胶体金的最佳抗体标记浓度为0.24 mg/mL,检测线最佳重组蛋白浓度为0.25 mg/mL,质检线最佳羊抗兔IgG抗体浓度为0.04 mg/mL。运用该试纸检测只需10~15 min,检测时间短、成本低、结果容易判断,可用于田间快速检测。本研究为樱桃小果病的综合防控提供了有效的监测和检测手段。

樱桃小果病毒1 RT-LAMP检测方法的建立与应用

樱桃小果病毒1(LChV-1)已成为严重影响樱桃产量与质量的重要因素之一。本研究基于环介导的等温扩增技术建立LChV-1的快速检测体系。依据NCBI数据库中LChV-1外壳蛋白基因序列设计了3组特异性引物,经优化,筛选获得1组特异性引物。以感染LChV-1的甜樱桃叶片总RNA为模板,构建RT-LAMP检测体系为:6.0 mM Mg^(2+),0.2μM的外引物和1.2μM的内引物,在57℃条件下反应60 min。使用RT-LAMP方法对35个疑似樱桃小果病的甜樱桃样品进行检测,发现有13个样品感染了LChV-1,检测结果与RT-PCR法一致。RT-LAMP法具有特异性强、快速等特点,适合对LChV-1田间样品的快速检测与鉴定。

环渤海湾地区甜樱桃小果病毒及樱桃病毒A的鉴定与调查

为了解环渤海湾地区甜樱桃[Cerasus avium(Linn.)Moench]中樱桃病毒的发生情况,选取该地区代表性樱桃示范园中甜樱桃品种‘红灯’为研究对象,以生长期功能叶片为材料,根据樱桃小果病毒-1(Little cherry virus-1,LChV-1)、樱桃小果病毒-2(Little cherry virus-2,LChV-2)和樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)基因组序列设计特异性检测引物进行RT-PCR扩增,结果扩增出与LChV-2、CVA预期片段337bp和652bp大小相符的目的片段,测序结果与基因组(基因登录号NC-005065、NC-003689)对应片段一致性分别为89.0%、98.2%,未检测到LChV-1。本研究完成了对环渤海湾地区甜樱桃‘红灯’样品LChV-2、CVA的检测调查,LChV-2检出率43.1%,CVA检出率60.8%;在该地区首次发现LChV-2、CVA复合侵染植株,复合检出率37.3%。结果表明该地区CVA发生较为普遍,可与LChV-2等其他病毒共同加重对甜樱桃的危害。

樱桃小果病毒1编码的P3.5蛋白生物学功能初探

以樱桃小果病毒-1(Little cherry virus 1,LChV-1)甜樱桃分离物为试材,采用分子克隆及浓杆菌侵染等方法,初步研究了其基因组编码的P3.5蛋白的亚细胞定位及致病性特征,以期为研究植物病毒编码的小分子量蛋白的生物学功能提供参考依据。结果表明:1)P3.5基因全长为96 nt,编码31个氨基酸,大小约3.5 kDa的跨膜蛋白。2)通过构建了带有GFP标签的荧光表达载体35S::P3.5-GFP,浸润本氏烟叶片后利用激光共聚焦显微镜观察,发现P3.5-GFP在细胞膜和细胞核膜均有分布。3)将P3.5构建到马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX),以此获得异源表达载体的PVX-P3.5。将PVX-P3.5接种本氏烟,14 d后,发现接种PVX-P3.5的本氏烟新叶并没有出现典型的症状,同时接种PVX空载体的植株也仅有轻微的花叶、黄化,表明在PVX异源表达系统中,P3.5并没有明显增强PVX的致病性而诱导寄主植物出现严重的症状,暗示P3.5可能不是作为症状形成的致病因子在病毒的侵染中发挥作用。

SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒定量分析中的应用

为了探讨SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒粒子定量分析中的应用前景,以复合感染李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf vi-rus,PDV)、樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)、樱桃小果病毒-2(Little cherry virus-2,LChV-2)的甜樱桃"红灯"Prunus avium cv.Red Lamp植株为研究对象,采用相对定量方法,分析各病毒的外壳蛋白基因的表达,用以指示病毒的增殖量。在花、幼叶、功能叶、衰老叶中均能检测到4个基因,但各基因表达量在各器官中存在差异。PNRSV-CP与CVA-CP表达模式相似,功能叶中明显高于其它器官,衰老叶中急剧降低。PDV-CP与LChV2-CP表达模式类似,幼叶中的表达量较高,功能叶片中较低。PNRSV-CP在花、功能叶中的表达显著高于其它3个病毒基因。LChV2-CP在各器官中的表达量均低于其余3个基因。该方法适用于植物组织内多种甜樱桃病毒增殖量的分析。

李树皮坏死茎痘伴随病毒RdRp蛋白介导的体外转录体系的创建

本研究针对李树皮坏死茎痘病毒(plumbark necrosis stempitting-associated virus,PBNSPaV),一种长线型病毒科(Closteroviridae)、葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)的正单链植物RNA病毒,利用大肠杆菌进行异源表达和纯化其编码的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)。通过体外实验发现,异源表达的重组RdRp具备复制酶活性,并能够识别PBNSPaV基因组的3'UTR区域,从而建立了RdRp介导的PBNSPaV体外转录体系。樱桃上病毒病多存在复合侵染现象,同科病毒之间的RdRp能否具有通用性未见报道,本研究选取田间对产量影响较重的同科病毒樱桃小果1号病毒(little cherry virus-1,LChV-1),利用已经建立的该病毒体外转录体系探究RdRp的通用性,实验结果显示,异源表达的LChV-1RdRp无法有效识别PBNSPaV相关启动子序列,表明该两种病毒的RdRp不具有通用性。本试验所创建的体外转录体系可用于研究PBNSPaV复制调控研究。