橘荔散结丸醇提物化学成分的UHPLC-QE-MS分析及其抗子宫肌瘤细胞的药效机制研究

【目的】运用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱串联质谱(UHPLC-QE-MS)技术分析橘荔散结丸醇提物的化学成分,并探讨其对子宫肌瘤细胞增殖的抑制作用及机制。【方法】(1)以UHPLC-QE-MS技术分析橘荔散结丸醇提物化学成分。(2)培养原代人子宫肌瘤细胞。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定不同浓度橘荔散结丸醇提物处理不同时间后的细胞增殖抑制率,并筛选后续实验中其2个高、低浓度。实验分为空白对照组,二甲基亚砜(DMSO)组,米非司酮组及橘荔散结丸醇提物高、低浓度组,分别给予相应处理后,采用流式细胞术检测细胞周期,Western Blot或定量聚合酶链反应(qPCR)法分别检测细胞Wnt/糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路关键蛋白Wnt 5b、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、表皮生长因子受体(EGFR)和基质金属蛋白酶2(MMP2)的蛋白、mRNA表达水平。【结果】鉴别橘荔散结丸醇提物主要化学成分91个,橘荔散结丸醇提物冻干粉与中成药橘荔散结片主要化学成分共有22个。橘荔散结丸醇提物各浓度组细胞增殖抑制率均大于空白对照组(P<0.05);橘荔散结丸醇提物高、低浓度组及米非司酮组G0/G1期细胞数均大于空白对照组,而G2/M期细胞数小于空白对照组(P<0.05);橘荔散结丸醇提物高、低浓度组及米非司酮组Wnt 5b、β-catenin、EGFR、MMP2蛋白、mRNA表达水平均低于与空白对照组(均P<0.05),而GSK-3β蛋白及mRNA表达水平与空白对照组无显著性差异(P>0.05)。【结论】UHPLC-QE-MS技术分离橘荔散结丸醇提物化学成分众多,主要成分具有氧化应激调节作用;橘荔散结丸醇提物可有效抑制子宫肌瘤细胞增殖,其分子机制与抑制Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路关键蛋白表达,进而干预子宫肌瘤细胞微环境氧化应激反应有关。

基于UHPLC-QE-MS的橘荔散结丸诱导子宫肌瘤细胞凋亡的炎症机制

目的运用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱串联质谱(UHPLC-QE-MS)技术分析橘荔散结丸的药物成分,围绕核因子-κB(NF-κB)信号通路探讨橘荔散结丸诱导子宫肌瘤细胞凋亡的炎症机制。方法①采用UHPLC-QE-MS技术分析橘荔散结丸化学成分。②培养原代人子宫肌瘤细胞,免疫组化法进行鉴定。实验分为5组,空白组常规培养,基质组加入0.05%DMSO培养,米非司酮组加入1×10-5 mol/L米非司酮含药液培养,橘荔散结丸高、低浓度组分别加入2 mg/mL和1 mg/mL橘荔散结丸含药液培养。采用流式细胞术检测子宫肌瘤细胞凋亡率,采用Western blot法检测子宫肌瘤细胞中IKKα、IKBα、p-IKBα、p65、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)蛋白表达情况,采用qPCR技术检测子宫肌瘤细胞中IKKα、IKBα、p65、TNF-α、IL-6 mRNA表达量。结果鉴别橘荔散结丸主要化学成分91个,冻干粉与中成药间共有22个。米非司酮组和橘荔散结丸高、低浓度组子宫肌瘤细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明显高于空白组和基质组(P均<0.05),且米非司酮组、橘荔散结丸高浓度组早期凋亡率和晚期凋亡率均明显高于橘荔散结丸低浓度组(P均<0.05),橘荔散结丸高浓度组早期凋亡率明显高于米非司酮组(P<0.05)。橘荔散结丸高浓度组和米非司酮组子宫肌瘤细胞中IKKα、p-IKBα、p65、TNF-α蛋白相对表达量均明显高于空白组和橘荔散结丸低浓度组(P均<0.05),且橘荔散结丸高浓度组和米非司酮组子宫肌瘤细胞中IL-6蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05);橘荔散结丸高浓度组子宫肌瘤细胞中p-IKBα、p65、IL-6蛋白相对表达量均明显低于米非司酮组(P均<0.05)。米非司酮组、橘荔散结丸高浓度组、橘荔散结丸低浓度组子宫肌瘤细胞中IKKα、IKBα、p65、IL-6 mRNA相对表达量和米非司酮组、橘荔散结丸高浓度组TNF-αmRNA相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05);橘荔散结丸高浓度组和米非司酮组IKBα、p65、IL-6 mRNA相对表达量均明显高于橘荔散结丸低浓度组(P均<0.05)。结论橘荔散结丸化学成分具有抗炎免疫调节作用,其治疗子宫肌瘤分子机制与干预肌瘤细胞微环境炎症反应密切相关。

橘荔散结丸有效部位对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的观察橘荔散结丸有效部位对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响。方法采用胶原酶消化法培养子宫肌瘤细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定子宫肌瘤细胞;将不同浓度的橘荔散结丸各提取部位组作用于子宫肌瘤细胞24 h后,用倒置显微镜观察细胞的形态变化,采用MTT法检测细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果原代培养的子宫肌瘤细胞纯度接近100%;基质组对细胞活力无明显影响(P>0.05),而不同浓度的橘荔散结丸提取部位组能显著降低子宫肌瘤细胞的增殖活力(P<0.05),且呈浓度依赖关系(P<0.05);橘荔散结丸醇提物组则能提高其凋亡率(P<0.05)。结论橘荔散结丸的各提取部位组通过降低子宫肌瘤细胞的增殖能力,其醇提物组能诱导子宫肌瘤细胞凋亡而使子宫肌瘤自然缩小或消退,可能是橘荔散结丸治疗子宫肌瘤的主要机理之一。

橘荔散结丸对子宫肌瘤雌、孕激素受体水平的影响

目的观察橘荔散结丸对子宫肌瘤患者子宫肌层及瘤体组织雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的影响。方法选用免疫组化的方法,检测15例仅服用橘荔散结丸3个月以上又手术治疗的患者子宫肌瘤及子宫肌层ER、PR水平,选择15例未曾服用相关中西药物而手术治疗的子宫肌瘤患者做对照。结果2组肌瘤组织EP、PR的水平均高于子宫肌层组织(P<0.05),而对照组EP、PR显著高于治疗组(P<0.05)。结论降低子宫肌瘤患者子宫肌层及其瘤体组织中的EP、PR水平可能是橘荔散结丸治疗子宫肌瘤的主要机理之一。

橘荔散结丸对子宫肌瘤模型大鼠血液流变学及血清IL-6、TNF-α水平的影响

目的观察橘荔散结丸对子宫肌瘤大鼠模型的干预作用和对血液流变学及血清IL-6、TNF-α水平的影响。方法以雌、孕激素负荷法建立子宫肌瘤的大鼠模型,观察橘荔散结丸对模型大鼠子宫系数、卵巢系数、子宫平滑肌厚度及全血黏度、血清IL-6、TNF-α水平的影响。结果与模型组比较,橘荔散结丸各治疗组大鼠子宫系数、子宫平滑肌厚度显著下降,卵巢系数上升(P<0.01,P<0.05),全血高切、中切、低切黏度升高,血浆黏度下降(P<0.05);血清TNF-α水平明显下降(P<0.05),血清IL-6水平上升(P<0.01)。结论橘荔散结丸治疗子宫肌瘤的作用机制可能是通过改善血液流变学,调节机体免疫功能,从而达到缩小瘤体的作用。

橘荔散结丸对子宫肌瘤组织雌激素受体表达水平的影响

【目的】探讨橘荔散结丸对子宫肌瘤组织和子宫肌层组织雌激素受体(ER)α、β亚型表达水平的影响及作用机理。【方法】将40例患者分为2组,服用橘荔散结丸治疗后有手术指征且要求手术者20例为治疗组,未曾服用中西药物治疗而要求手术者20例为对照组。采用放射免疫法检测两组子宫肌瘤组织及周围正常子宫肌层组织的ERα、ERβ的表达水平。【结果】两组子宫肌瘤组织和子宫肌层组织均存在ERα、ERβ表达,且子宫肌瘤组织中ERα、ERβ的表达水平高于子宫肌层组织(P<0.01),同时发现ERα在子宫肌瘤组织与子宫肌层组织中表达水平高于ERβ(P<0.05);而治疗组子宫肌瘤组织ERα、ERβ表达水平低于对照组(P<0.01);治疗组子宫肌层组织ERα表达水平低于对照组(P<0.05),而两组子宫肌层组织ERβ表达水平比较差异无显著性意义(P>0.05)。【结论】子宫肌瘤的发生与ERα、ERβ在子宫局部的表达相关;降低子宫肌瘤患者肌瘤组织中ERα、ERβ水平及子宫肌层ERα水平可能是橘荔散结丸治疗子宫肌瘤的主要机理之一。

橘荔散结丸治子宫肌瘤150例临床体会

本文对近三年来确诊为子宫肌瘤的患者150例,用行气散结,软坚敛涩,益气活血法的橘荔散结丸治疗,系统观察,日服三次,每次6克,三个月为一疗程,观察1～3疗程。结果:150例中,治愈18例,有效111例,无效21例。

橘荔散结丸对子宫肌瘤模型大鼠子宫肌层ER、PR和EGFR表达的影响

【目的】观察橘荔散结丸对子宫肌瘤模型大鼠雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、表皮生长因子受体(EGFR)表达及组织病理学的影响,探讨橘荔散结丸治疗子宫肌瘤的作用机制。【方法】选用SD大鼠,随机分为空白对照组,模型对照组,西药对照组(米非司酮,剂量为4.7 mg/kg),中药对照组(桂枝茯苓胶囊,剂量为0.52 g/kg),橘荔散结丸低、中、高剂量组(中药低、中、高剂量组,剂量分别为9.86、19.73、39.45 g/kg);除空白对照组外,其他组均采用雌、孕激素负荷法复制子宫肌瘤大鼠模型,观察各组大鼠子宫肌层ER、PR和EGFR的表达及病理学改变。【结果】模型对照组大鼠子宫明显增大,子宫肌细胞排列紊乱,子宫肌层ER、PR和EGFR的表达均显著高于空白对照组(P<0.05);橘荔散结丸各剂量组子宫平滑肌排列趋于正常,子宫肌层ER、PR和EGFR的表达明显下降,其中中剂量组与模型对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】橘荔散结丸治疗子宫肌瘤的作用机制可能与其能抑制子宫肌层ER、PR和EGFR的表达有关。

橘荔散结丸对子宫肌瘤孕激素受体及其基因表达的影响

目的:观察橘荔散结丸对子宫肌瘤孕激素受体(PR)及其基因(PRmRNA)表达的影响。方法:将30例患者分为2组。服用橘荔散结丸治疗后有手术指征且要求手术者15例为治疗组,未曾服用中西药物治疗而要求手术者15例为对照组。主要观察术后血清性激素水平变化;并用免疫组化法与原位杂交法分别检测子宫肌瘤PR水平及PRmRNA表达情况。结果:2组血清性激素各项指标比较,差异均无显著性意义(P>0.05)。2组瘤体组织PR水平均高于正常子宫组织(P<0.05),而且对照组子宫瘤体PR水平及PRmRNA表达均高于治疗组(P<0.05)。结论:降低子宫肌瘤患者子宫肌层及其瘤体组织中的PR水平及其PRmRNA表达可能是橘荔散结丸治疗子宫肌瘤的主要机理之一。

从橘荔散结丸浅析罗元恺教授治疗子宫肌瘤经验

橘荔散结丸由罗元恺教授创制,具有活血化瘀、燥湿化痰、软坚散结兼益气养血之功,主要用于治疗子宫肌瘤,疗效确切。罗元恺认为[1]子宫肌瘤的形成与气滞血瘀、痰凝和正气不足有关,治宜攻补兼施,强调经期与平时治疗用药不同。本文分析了橘荔散结丸组方思路,并从该药对子宫肌瘤患者NK细胞活性的恢复、机体免疫功能的提高以及对子宫肌层及瘤体组织雌(ER)、孕激素受体(PR)、孕激素受体基因(PRmRNA)表达影响的角度探究其作用机理。

橘荔散结丸对子宫肌瘤组织芳香化酶P450表达影响*

目的:探讨橘荔散结丸对子宫肌瘤组织P450arom表达的影响,进一步明确P450arom的表达与子宫肌瘤发生的相关性。方法:将40例患者分为2组,服用橘荔散结丸(主要由橘核、荔枝核、续断、小茴香等组成)治疗3个月(一个疗程)后有手术指征且要求手术者20例为治疗组,未曾服用中西药物治疗而要求手术者20例为对照组。采用放射免疫法检测两组子宫肌瘤组织及周围正常子宫肌层组织P450arom水平。结果:两组子宫肌瘤组织和子宫肌层组织均存在P450arom表达,且子宫肌瘤组织P450arom水平均高于肌层组织(P<0.01);而治疗组肌瘤组织P450arom显著低于对照组(P<0.01);两组子宫肌层组织P450arom比较无统计学意义(P>0.05)。结论:子宫肌瘤发生与肌瘤组织局部P450arom高表达相关;降低子宫肌瘤患者瘤体组织中P450arom水平可能是橘荔散结丸治疗子宫肌瘤的主要机理之一。

橘荔散结丸联合米非司酮对子宫肌瘤组织雌激素受体表达水平的影响

目的:观察橘荔散结丸联合米非司酮治疗对子宫肌瘤组织雌激素受体表达水平的影响。方法:按照随机数字表的方法选取80例来我院就诊的有手术指征并要求手术的子宫肌瘤患者作为研究对象,通过抽签的方法分为治疗组和对照组各40例,其中对照组患者治疗方案选择手术治疗,而治疗组患者在手术治疗基础上给予橘荔散结丸联合米非司酮口服治疗,通过放射免疫法检测不同治疗方案对患者雌激素受体表达水平的影响。结果:经过统计发现,雌激素受体(ER)α、β亚型在两组患者的子宫肌瘤组织以及子宫肌层组织中均有表达,其中子宫肌瘤组织(ER)α、β的表达水平和子宫肌层组织相比明显升高,子宫肌瘤组织以及子宫肌层组织中ERα的表达水平高于ERβ,比较差异具有统计学意义(P<0.05);治疗组患者子宫肌瘤组织ERα、ERβ的表达水平和对照组相比降低,治疗组子宫肌层组织的ERα的表达水平和对照组相比降低,比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:子宫肌瘤的发生和发展与患者体内雌激素受体水平密切相关,橘荔散结丸联合米非司酮通过降低患者子宫肌瘤组织中的ERα、ERβ的水平以及肌层组织中的ERα水平达到治疗目的。

橘荔散结丸有效部位对子宫肌瘤细胞EGF、EGFR、PR-A表达的影响

目的探讨橘荔散结丸各有效部位对子宫肌瘤细胞孕激素受体亚型(PR-A)、表皮生长因子(EGF)、表皮生长因子受体(EGFR)表达水平的影响。方法采用胶原酶消化法对人体的子宫肌瘤细胞进行原代培养,运用现代技术提取橘荔散结丸,将不同浓度的橘荔散结丸各有效部位作用于子宫肌瘤细胞24 h后,分别采用酶联免疫法、免疫细胞化学技术及免疫荧光技术检测子宫肌瘤细胞EGF分泌变化、及EGFR和PR-A表达的改变。结果与空白对照组相比:高浓度醇提物、水提醇沉液及挥发油组EGF分泌均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);橘荔散结丸醇提物、水提醇沉液、水提醇沉物及挥发油组EGFR阳性表达细胞的平均光密度(MOD)均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),挥发油组间成浓度依赖关系(P<0.05);各橘荔散结丸有效部位组PR-A阳性表达细胞的MOD呈显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与阳性对照米非司酮(RU486)组相比:橘荔散结丸的醇提物、水提醇沉液、水提醇沉物及挥发油的高浓度组的EGFR表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究表明橘荔散结丸各有效部位可降低子宫肌瘤细胞EGF的分泌或调控子宫肌瘤细胞PR-A、EGFR的表达,各有效部位协同作用可能是橘荔散结丸治疗子宫肌瘤的主要机理之一,并且橘荔散结丸各有效部位对EGFR的降调作用优于RU486,为药物筛选、精简处方奠定基础。