过表达veA对橘青霉美伐他汀生物合成的影响

在丝状真菌中,全局性调控因子VeA广泛存在并高度保守,调节多个次级代谢基因簇和生长发育.在橘青霉中克隆veA的基础上,通过农杆菌介导的转化获得了OE∷veA菌株.结果显示:veA过表达后,分生孢子产量下降61%,美伐他汀产量提高3倍.光照能促进橘青霉中veA的表达从而抑制橘青霉生长发育.这些结果提示在橘青霉中veA和孢子形成、美伐他汀合成密切相关.

橘青霉菌丝球形成条件及其处理废水的应用

探讨了橘青霉 (Penicilliumcitrinum)呈球状体生长的条件和形成的机理。发现在培养液初始pH为 7.0 ,孢子年龄为16～ 2 0天 ,孢子悬液浓度为 10 5个·mL-1,表面活性剂Tween80或TritonX - 10 0质量浓度为 1g/L ,摇床转速为 140r/min的条件下 ,于 2 5℃培养 5天 ,可形成大小适中 ,有一定机械强度 ,光滑均匀的菌丝球。孢子的聚集在菌丝球的形成中起了重要作用。用此菌丝球吸附质量浓度为 5 0mg·L-1的 1 氨基 2 萘酚 4 磺酸水溶液模拟处理染料废水 ,吸附率达到 6 2 .4%。

液相色谱—串联质谱法(LC-MS/MS)测定固态红曲米(粉)中橘青霉素

使用液相色谱—串联质谱法,建立了一种萃取溶剂少、操作简单、灵敏性高,适合固态红曲米（粉）中痕量橘青霉素测定的方法。样品经甲醇提取后,以甲醇∶水（含0.1%甲酸和2 mmol·L^-1乙酸铵）体积比为90∶10作流动相在液相色谱柱上进行分离,质谱采用电喷雾源（ESI）正离子方式,选择反应监测模式（SRM）下对橘青霉素实现定性和定量分析。橘青霉素的标准品在0.1-100μg·L^-1范围线性良好,y=6 E＋07x＋30800,R^2=0.999,不同浓度添加回收试验所得样品回收率为80.9%-107.3%,方法的精密度（RSD）为2.0%,样品检测限为5μg·kg^-1。同时将该方法应用于12个从不同地域购买的红曲米（粉）产品,其中10个样品受到橘青霉素的污染,污染量为0.14-44.24 mg·kg^-1。

橘青霉全局性调控因子Pci-veA基因的克隆与分析

克隆和分析橘青霉Penicillium citrinum的全局性调控因子Pci-veA基因.设计简并引物,用PCR扩增获得Pci-veA基因的核心片段,利用RACE和TAIL-PCR技术对核心片段的3’和5’末端进行延伸,将获得的3个片段进行拼接并设计引物,克隆得到完整的Pci-veA基因.结果表明:Pci-veA基因全长1 774bp,包含一个70bp的内含子,cDNA序列为1 704bp,编码567个氨基酸;Pci-veA与多种已报道的真菌veA基因具有较高的同源性,且含有veA基因特定的双组份核蛋白定位信号区NLSI和Pat7定位信号区域.这些结果为进一步研究P.citrinum中美伐他汀生物合成的全局调控机理奠定了基础.

美伐他汀产生菌橘青霉原生质体的制备与再生

确定美伐他汀产生菌橘青霉(Penicillium citrinum)的原生质体的制备及再生的最佳条件.通过正交实验设计的方法,确定了接种量约108个孢子时,于85 mL YPL-20液体培养基中25℃,210 rpm,培养60 h,0.5%纤维素酶和蜗牛酶等比例混合酶液,在30℃酶解2 h,以蔗糖为高渗稳定剂的PGA培养基,原生质体再生形成率可达42.45%.本结果为深入研究橘青霉菌株的原生质体诱变、构建基因工程菌和提高美伐他汀产量奠定基础.

嵊州桃形李采后橘青霉分离鉴定及室内抑菌试验

嵊州桃形李果实营养丰富,但成熟于高温季节,采后易受霉菌感染;为了减少霉菌对嵊州桃形李采后的感染,鉴定致病霉菌种类并开展抑菌试验很有必要。本研究从发病的嵊州桃形李果实分离到一株致病霉菌,经形态学和分子生物学鉴定,并用施保功和苯甲·嘧菌酯进行室内抑菌试验,结果发现:分离到的致病菌为橘青霉Penicillium citrinum(TXL-03),菌丝有分支且分生孢子串生;该菌株寄主具广谱性,对雪梨、苹果、油桃、樱桃、小番茄、葡萄、芒果、宝石李和香蕉接种后均可致病;施保功和苯甲·嘧菌酯均可有效抑制该菌丝生长和孢子萌发,但施保功的抑制效果更好,更适宜于嵊州桃形李采后霉菌防治。

香茅醛、冬青油及其复配物熏蒸和绝氧处理对橘青霉的抑制作用

采用纸片扩散法测定了香茅醛、冬青油以及两者的复配油对橘青霉的抑制效果。结果表明:香茅醛具有较强抑菌作用,冬青油能够减缓霉菌生长速度,两者复配具有协同作用。香茅醛和复配油作熏蒸剂对橘青霉的杀菌率均能在7 d内达到100%。三种成分作为熏蒸剂和绝氧法结合使用,均能提高杀菌效率。同时使用脱氧剂进行绝氧处理,其中的吸附剂成分会对它们产生吸附作用,使它们的熏蒸表现出一定的缓释效果。

马齿苋内生菌橘青霉和波兰青霉中抗青枯菌的活性物质

为了挖掘农作物病害生物防治新资源,以药用植物马齿苋(Portulaca oleracea)为材料,通过培养基种植法分离和纯化其根、茎、叶中的内生菌,以青枯菌(Ralstonia solanacearum)的抑菌试验评价其活性,采用菌落形态观察和ITS序列分析鉴定菌种。结果表明,从马齿苋筛选出2种具有抑制青枯菌的内生菌橘青霉(Penicillium citrinum)和波兰青霉(P.polonicum),采用液相与四极杆飞行时间串联质谱(UPLC-QTOF-MS)鉴定2种内生菌的主要活性物质为橘霉素,其对青枯菌的抑制效果比链霉素更好。因此,这为植物青枯病的生物防治提供科学依据。

ε-聚赖氨酸对樱桃采后病原菌橘青霉和链格孢菌的抑菌作用研究

目的 探究ε-聚赖氨酸(ε-polylysine,ε-PL)对樱桃果实采后病原菌橘青霉(Penicillium citrinum)和链格孢菌(Alternaria alternata)的抑菌作用和抑菌机制。方法 本研究测定100、200、400、800 mg/Lε-PL处理对2种病原菌菌丝生长、孢子萌发、细胞膜透性的影响;采用扫描电子显微镜(scanningelectron microscope,SEM)观察ε-PL处理对病原菌孢子的形态的影响;并在樱桃果实上接种2种病原菌,观测ε-PL处理在果体上的抑菌作用。结果 ε-PL对P.citrinum和A.alternata菌落直径扩展的抑制效果随着处理浓度的增加而提高,大于200 mg/L的ε-PL显著抑制孢子萌发;经ε-PL处理后2种病原菌的电导率、OD_(280nm)、OD_(260nm)均显著升高(P<0.05),细胞膜通透性增加,蛋白质和核酸等内容物渗漏,细胞膜完整性遭到破坏;经SEM观察发现,ε-PL处理后P. citrinum和A. alternata孢子变形、凹陷,失去正常的细胞形态;大于400 mg/L的ε-PL处理能抑制樱桃果实上的病斑扩展。结论 ε-PL处理可以破坏P. citrinum和A. alternata的细胞膜,导致细胞内容物外渗,使菌丝生长和孢子萌发受阻,进而抑制病原菌的生长,同时,ε-PL处理可以抑制P.citrinum和A. alternata对果实的侵染,在樱桃的采后保鲜方面具有一定的防腐效果。

基于基因测序鱼露发酵橘青霉YL-1鉴定及安全性评价

目的:为弥补传统方法在检测菌株产毒素上的不足,用基因组方法分析橘青霉YL-1(Penicillium citrinum YL-1,P.citrinumYL-1)物质生物合成途径及关键基因,以此评价P.citrinumYL-1在鱼露发酵生产过程中的安全性。方法:应用ITS基因测序鉴定菌株,利用Illumina平台HiSeq测序技术对菌株YL-1进行基因组survey测序,通过生物信息分析产青霉毒素、黄曲霉毒素及典型丝状真菌毒素的非核糖体多肽合成代谢、聚合酮酶代谢、聚合酮酶-非核糖体多肽联合代谢、萜类化合物代谢和氨基酸相关代谢途径及基因,考察菌株YL-1产真菌毒素能力,判断其是否存在产真菌毒素的潜在危害。结果:ITS鉴定菌株YL-1与P. citrinum同源性99%,survey测序结果表明P. citrinum YL-1全基因组大小为31.92 Mb,GC为46.27%。利用Maker2基因预测技术得到预测基因11 980个。其中,被KOG注释基因5 417个,被COG注释基因4 946个;比对KEGG数据库被注释通路323条,注释基因3 525个。代谢分析表明,注释到可能产真菌毒素相关的代谢途径有5条,仅注释到1种产黄曲霉毒素代谢途径的同源基因Afld及其他5种相关基因,但并未注释到其完整代谢途径。结论:ITS基因测序鉴定菌株YL-1为P. citrinum,P. citrinum YL-1基因注释存在1种产黄曲霉毒素的同源基因及其他5种相关基因,虽不存在完整代谢链,但P. citrinum YL-1运用于鱼露及相关产品的发酵安全性仍值得进一步考察。

橘青霉侵染对杨梅果实酚类物质代谢作用的影响

以采前套袋控制病原菌潜伏侵染的杨梅果实为材料,采后接种橘青霉病菌,旨在研究橘青霉侵染对杨梅果实酚类物质含量及相关氧化酶活性变化的影响。结果表明:橘青霉侵染初期,杨梅果实细胞多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)活性呈上升趋势,酚类物质快速合成以提高自身的抗病能力。而同时期苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性并没有相应增加,反而下降较快,致使木质素合成受阻,说明橘青霉侵染虽然诱导杨梅果实产生一定的抗病性,但这种抗病能力有限。贮藏中后期,虽然POD活性略有下降,PPO活性保持平稳,但二者始终处于较高水平,从而导致前期积累的酚类物质被大量降解,加上前期木质素合成受阻的影响,橘青霉更容易穿透杨梅果实细胞壁,进入细胞组织内繁殖生长,最终导致果实腐败。

红树植物老鼠簕内生真菌橘青霉P4-5-1中的1个新异喹啉酮生物碱

目的研究老鼠簕内生真菌橘青霉(Penicillium citrinum)P4-5-1的化学成分。方法利用正反相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱以及半制备高效液相色谱(HPLC)等技术对P4-5-1次生代谢产物进行分离,利用高分辨质谱、一维及二维核磁共振等波谱鉴定技术确定化合物结构。结果从P4-5-1大米发酵物中分离得到了6个化合物,分别为4-methoxy-2-methylisoquinolin-1(2H)-one(1)、fischexanthone(2)、penicitrinone A(3)、ent-aspergoterpenin C(4)、sydowiol E(5)和citrinin(6)。结论化合物1为新异喹啉酮生物碱,命名为citrinadin D;化合物2、4和5首次从该种真菌中获得。

过表达全局调控因子LaeA对橘青霉美伐他汀的合成及产孢的影响

【目的】研究橘青霉中全局性调控因子Lae A过表达对美伐他汀生物合成过程及产孢的影响。【方法】同源克隆法从橘青霉中克隆获得lae A基因,构建p Gi HTGi-lae A载体,经农杆菌介导转化转入橘青霉,利用hygromycin基因进行阳性克隆子的PCR筛选。使用HPLC方法比较PGA发酵液中橘青霉野生型菌株WT和Lae A过表达菌株OE::lae A的美伐他汀产量差异。血球计数法进行孢子产量比较。荧光定量PCR方法分析WT和OE::lae A中美伐他汀合成基因簇表达量。【结果】成功构建p Gi HTGi-lae A载体,并获得Lae A过表达橘青霉菌株(OE::lae A)。OE::lae A中,lae A基因表达量较WT增加29%,mlc B表达量较WT增加72%,mlcR表达量增加153%,孢子产量由(2.38±0.24)×107/cm2减少到(1.40±0.11)×107/cm2,美伐他汀产量从(35.77±4.63)mg/L提高到(201.46±9.98)mg/L。【结论】在橘青霉中过表达Lae A可能通过提高mlcR和mlc B基因的转录来增加美伐他汀的产量,同时过表达lae A基因不利于孢子的形成。这些结果为美伐他汀生物合成的全局性调控和高产菌株的开发提供基础。

深海橘青霉Penicillium citrinum SCSIO41305化学成分及其乙酰胆碱酯酶抑制活性研究

目的研究1株采自深海沉积物中橘青霉Penicillium citrinum SCSIO41305的次级代谢产物。方法利用薄层色谱法(TLC)、硅胶柱层析法、凝胶柱层析法、中压制备液相色谱法(MPLC)、高效液相色谱法(HPLC)等分离方法对该菌株发酵产物进行分离纯化;通过核磁共振(NMR)等现代波谱学方法,同时结合相关文献进行数据分析,鉴定化合物结构。结果从橘青霉Penicillium citrinum SCSIO41305的代谢产物中分离得到7个化合物,分别是citrininc(1)、ergosterol(2)、penicillenol A_(1)(3)、penicillenol A_(2)(4)、penicitrinone A(5)、ozazinocyclo-(2,3-dihydroxyl-trp-tyr)(6)、3,4,5-trimethylbenzene-1,2-diol(7)。活性测试结果表明,化合物2对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用,最低抑菌浓度(MIC)值为0.50 mg/mL,化合物3和4对乙酰胆碱酯酶有较好的抑制作用,其IC_(50)分别为10.43和15.41μmol/L。

广西南宁巨峰葡萄果实溢糖性霉斑病病原菌鉴定

【目的】分离、鉴定广西南宁葡萄园中引发巨峰葡萄果实溢糖性霉斑的病原菌,为该病的防治提供参考依据。【方法】采用5点采样法在发病葡萄园区进行溢糖性霉斑发病情况调查和症状观察;随机选择100个具有典型形态特征的单一霉斑,挑取病原菌孢子进行菌株分离和纯化培养,根据柯赫氏法则分别验证其形成霉斑的致病力,并通过形态学观察及分子生物学手段对病原菌进行鉴定。【结果】被调查葡萄园中,2015年冬季果、2016年夏季和冬季果的葡萄果实溢糖性霉斑发病率分别达86.00%、87.32%和89.33%,发病指数分别为52.80、62.40和58.27。从100个霉斑样本中分离获得的优势菌株均具有相似的菌落形态,随机选取其中8株菌株进行验证,结果发现8株菌株均具有形成霉斑的致病力。根据形态学特征和分子生物学鉴定结果,确认分离所得的病原菌为橘青霉(Penicillium citrinum)。【结论】橘青霉(P.citrinum)是引起广西南宁巨峰葡萄果实溢糖性霉斑的病原菌之一,当前应从栽培技术入手做好综合防控工作。

生防酵母菌结合钼酸铵对冬枣采后主要病害防治的研究

研究美极梅奇酵母菌(Metschnikowia pulcherrima)与不同浓度(5、10、15、20 mmol/L)的钼酸铵结合使用对冬枣果实采后黑腐病和青腐病的防治效果以及钼酸铵对美极梅奇酵母菌生长的影响。结果表明,不同浓度的钼酸铵对美极梅奇酵母菌的生防效果影响不同,其中美极梅奇酵母菌与较低浓度(5 mmol/L)的钼酸铵溶液结合使用时对冬枣果实黑腐病和青腐病的防治效果最佳,美极梅奇酵母菌在含有5 mmol钼酸铵的NYDB液体和固体培养基以及冬枣伤口上的生长都未受到明显的抑制。因此,美极梅奇酵母菌与钼酸铵结合使用在控制冬枣采后贮藏中的病害方面具有潜在的应用价值。

城市常见落叶的纤维素高效降解菌种分离

为进一步提高绿化废弃物的再利用,选择中国北方城市常见落叶(悬铃木落叶、小叶女贞落叶)为主要实验材料,以污水厂剩余污泥、土壤、猪粪、鸡粪等为菌剂,采用摇瓶发酵法研究不同菌剂对落叶的微生物降解效果。结果表明:以难降解成分纤维素为主要指标,单组份菌剂中鸡粪的生物降解效果最佳,纤维素降解率可达31.6%;双组份菌剂中鸡粪和土壤组合的降解效果最佳,纤维素降解率可达31.0%;以15 d的降解物为菌源,对纤维素高效降解菌种进行筛选和分离,通过分子生物学方法鉴定主要优势微生物为橘青霉菌属(penicillium citrinum),可作为高效堆肥的纤维素降解菌。

产黄酮番木瓜内生真菌的筛选和鉴定

为开发植物内生真菌这一微生物资源,采用组织分离法从番木瓜植株的叶片、果实和茎中分离内生真菌。通过黄酮类化合物显色反应、薄层层析法(TLC)、紫外光谱法(UV),对番木瓜内生真菌的次生代谢产物进行初步分析,筛选出1株产黄酮类物质的内生真菌菌株,并利用分生孢子形态特征和真菌内转录间隔区序列(Internal transcribed spacer,ITS)对该菌株进行分析鉴定。结果表明,从番木瓜果实中分离获得编号为G41的内生真菌菌株可归类为青霉属橘青霉(Penicillium citrinum)。研究证实番木瓜果实中存在可产黄酮类物质的内生真菌菌株,具有进一步开发利用的潜在价值。

海洋来源真菌Penicillium citrinum的化学成分及其活性研究

为研究海洋来源真菌橘青霉(Penicillium citrinum)的次生代谢产物及其活性,采用凝胶柱层析、正相硅胶柱层析以及高效液相色谱等方法对菌株发酵液的乙酸乙酯提取物进行分离,通过LC-MS、NMR结构鉴定和文献数据对比等方法进行鉴定。结果表明,分离到的7个已知化合物经鉴定分别为3,3-二吲哚烷基-1,2-丙二醇(1)、robillafuran (2)、asperfuran A (3)、gamahorin (4)、7-羟基-5-甲氧基-4,6-二甲基-异苯并呋喃酮(5)、5-甲氧基-4,6-二甲基-7-氧-α-L-鼠李糖基-异苯并呋喃酮(6)、pestynol (7)。化合物1-7均为首次从青霉属真菌中分离得到,化合物1首次从真菌的次生代谢产物中发现。活性筛选结果表明,化合物7具有抗菌活性,化合物1和7对Marc-145细胞具有较强的细胞毒活性,半数致死浓度(Median Lethal Concentration, LC)值分别为57.397μg/mL和35.386μg/mL;在LPS诱导的BV-2细胞模型中,化合物2和4在浓度为12μg/mL时,BV-2细胞的存活率分别为76.77%和69.69%,具有潜在的抗神经炎症活性。

上海有机所在天然产物Cyclocitrinols的统一式合成中取得新进展

Cyclocitrinols是从橘青霉真菌的次级代谢产物中分离得到、含有独特[4.4.1]桥环结构的C25甾体天然产物,初步研究表明该家族中多个天然产物可在10μM的低浓度下诱导环腺苷酸cAMP的产生,因此在治疗神经紊乱相关疾病方面显示出了巨大的潜力;然而其进一步的生物活性研究却受限于自然界中天然产物的稀缺。