茶树橙花叔醇和芳樟醇樱草糖苷含量全基因组关联分析及候选基因预测

橙花叔醇与芳樟醇是广泛分布于植物中的挥发性萜烯醇类化合物,在茶树新梢中主要以樱草糖苷形式存在,提高其含量对茶叶香气品质改良具有重要意义。为揭示茶树橙花叔醇和芳樟醇樱草糖苷的遗传机制,本研究以169个茶树自然杂交后代单株为关联群体,利用均匀分布在茶树染色体上的675,245个SNP标记,对3个年份下茶树新梢中橙花叔醇与芳樟醇樱草糖苷含量进行全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)。结果表明,橙花叔醇与芳樟醇樱草糖苷含量的表型变异系数为60.83%~80.08%,广义遗传力分别为51.29%与61.87%,基本符合正态分布,具有典型的数量性状遗传特征。全基因组关联分析共检测到50个显著关联位点,各位点分别对橙花叔醇和芳樟醇樱草糖苷含量变化的贡献率均超过20%,其中橙花叔醇樱草糖苷含量(nerolidol primeveroside content,NPC)变化位点最大贡献率为38.73%,芳樟醇樱草糖苷含量(linalool primeveroside content,LPC)变化位点最大贡献率为39.07%。通过等位变异效应分析,鉴定出4个主效SNP位点及其优异等位变异,并发现1个可同时调控NPC和LPC的一因多效位点。结合已有的文献报道和基因的功能注释,筛选出每个显著位点置信区间内最有可能的候选基因共59个,主要涉及茶树的糖类代谢、转录调控、萜烯类生物合成等多个生物学过程,其中26个基因在适制绿茶品种和适制乌龙茶品种单芽中的表达水平存在显著差异。本研究为深入解析茶树橙花叔醇和芳樟醇樱草糖苷含量的遗传机制提供了新的信息,为加速培育高香型优异茶树新品种提供了重要的基因资源。

橙花叔醇通过Wnt-β-catenin通路调控黑色素瘤细胞的恶性生物学行为

目的:探讨橙花叔醇通过Wnt-β-catenin通路抑制黑色素瘤A-375和WM-115细胞恶性生物学行为的分子机制。方法:体外培养黑色素瘤细胞A-375和WM-115,用不同浓度的橙花叔醇处理,采用SRB法和克隆形成实验、FCM术、Transwell实验和细胞划痕实验、DCFH-DA染色法、qPCR和WB法分别检测橙花叔醇对A-375和WM-115细胞的增殖能力、细胞周期和凋亡、迁移能力、活性氧(ROS)水平和Wnt-β-catenin通路及其下游相关基因和相关蛋白表达的影响。利用ULCAN和GEPIA2数据库分析黑色素瘤中Wnt-β-catenin通路的激活与患者预后的关系。结果:与对照组比较,橙花叔醇处理组A-375和WM-115细胞的增殖能力受明显抑制(均P<0.01)、细胞周期阻滞于G2/M期(P<0.05或P<0.01)、细胞凋亡率增加(均P<0.01)、迁移能力降低(P<0.05或P<0.01)、ROS水平升高(均P<0.01)、Wnt-β-catenin通路被抑制而其下游基因和蛋白表达明显上调(均P<0.01)。数据库数据分析显示,WNT1基因高表达患者OS低于低表达患者(P<0.01)。结论:橙花叔醇通过上调A-375和WM-115细胞中ROS水平影响Wnt-β-catenin通路,从而抑制其恶性生物学行为;Wnt-β-catenin通路可能是黑色素瘤治疗的潜在靶点。

脱氢橙花叔醇的选择性加氢反应研究

脱氢橙花叔醇在催化剂存在和常压(或接近常压)下发生选择性部分氢化反应,形成橙花叔醇.脱氢橙花叔醇氢化反应的合理条件:乙炔化产物中加入质量分数0.075%的Lindlar催化剂(Pd含量5%)、甲苯(按每g乙炔化产物中加入2 mL甲苯的比例计)和少量喹啉,50～60℃通氢气还原,反应终点由色谱跟踪分析结果确定.橙花叔醇的氢化反应得率可达96.2%.

大豆橙花叔醇合酶基因克隆及功能鉴定

通过同源检索得到大豆橙花叔醇合酶(nerolidol synthase,Gm NES)基因Glyma13g32380,采用RT-PCR方法从经水杨酸(SA)处理的大豆材料中,克隆到c DNA片段,其包括完整的ORF(1 605bp)。共编码534个氨基酸,蛋白分子量约62.338 k D。该蛋白序列与番茄等植物的NES序列同源性较高,包含DDXXD保守结构域。将该ORF构建入p ET28a表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达为可溶性蛋白。通过与法尼基焦磷酸合酶基因在大肠杆菌中进行微生物代谢工程共表达,气质联用检测到橙花叔醇的生成。同时还检测到SA模拟生物胁迫处理诱导大豆叶片产生橙花叔醇,并且在1.0 mmol/L SA处理下,Gm NES基因表达量明显上调。本研究克隆了大豆橙花叔醇合酶基因,并鉴定了其生化功能及其在植物体内的生理相关性,为研究大豆萜类代谢及对病虫害的防御反应和抗性品种选育提供了理论依据。

橙花叔醇植物资源及利用的研究

讨论了芳香药用植物秘鲁香、吐鲁香及降香黄檀的分布、生长环境及适应性．西双版纳热带植物园引种栽培表明，它们有各自的生育节律和生态适应幅度．这三种植物的树干和根产生的香树脂，可用于提取芳香油，主要成分为橙花叔醇（Ｎｅｒｏｌｉｄｏｌ），含量为５０．７９％～８０．９２％．引种的秘鲁香和吐鲁香精油的主要成分不同于原产地，而原产地的主要成分为肉桂酸苄酯（Ｃｉｎｎａｍｅｉｎ）、肉桂酸（Ｃｉｎｎａｍｉｃａｃｉｄ）、苯甲酸苄酯（Ｐｈｅｎｙｌｂｅｎｚｏａｔｅ）等．

HPLC法测定不同产地降香中橙花叔醇的含量

目的:建立降香药材中橙花叔醇的含量测定方法并比较不同产地降香中橙花叔醇的含量。方法:色谱柱:迪马公司 Dia-monsil C_(18)(200 mm×4.6 mm,5μm),流动相:甲醇-水(80:20),流速:1.0 mL·min^(-1),检测波长:220 nm。结果:橙花叔醇在1.9～186.0μg范围内线性关系良好(r=0.9995),平均回收率为98.9%(RSD=1.2%),不同产地药材中橙花叔醇的含量范围为0.017%～0.670%。结论:不同产地的降香药材中橙花叔醇含量存在显著性差异。

柱切换色谱法同时测定香丹注射液中水溶性成分及橙花叔醇的含量

目的：采用柱切换程序进样高效液相色谱法对香丹注射液中高含量水溶性成分（丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B）及微量挥发性成分橙花叔醇（含量相差近3个数量级）的含量进行测定。方法：以Agilent SB-C18预柱为预处理柱，Lichrospher C18（4．6min×250mm，5μm）为分析柱；预处理流动相为1％醋酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，流速0．5mL·min^-1；分析流动相为0．05％醋酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，流速1．0mL·min^-1；检测波长：0min，280nm，40min，210nm；柱温40℃；进样程序及进样量为：0min，10灿供试品溶液1；15．3min，200μL供试品溶液2。结果：丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B和橙花叔醇在实验浓度范围内线性关系良好（R^2〉10．9990）；平均加样回收率在100％-102％，RSD小于3．0％；丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B和橙花叔醇的检出限分别为17．1，0．473，60．2，50．6μg·L^-1。结论：方法简便、灵敏，重复性与加样回收率良好，可用于香丹注射液质量分析。

催化剂对橙花叔醇异构化反应影响的研究

钒铝钨酸盐类无机催化剂、原钒酸酯类和原钒酸硅酯类有机催化剂均可对橙花叔醇 的催化异构化反应起作用。研究结果表明,3类催化剂中催化效果较好的分别是偏钒酸铵、 原钒酸丁酯和原钒酸三苯基硅酯,它们作为单一催化剂均可使橙花叔醇发生较好的异构化反 应,金合欢醇的产率分别为37．1％、37．2％和32．O％。在单一催化剂对比研究的基础上,将 偏钒酸铵、原钒酸丁酯和原钒酸三苯基硅酯等3种比较好的催化剂进行了多元复配应用试验,研究结果表明, 这3种催化剂的复配应用虽然可以轻微提高橙花叔醇异构化反应效果,但未表现出明显的增效和协同作用。

HPLC法测定降香挥发油羟丙基-β-环糊精包合物中反式-橙花叔醇

[目的]建立用H PLC法测定降香挥发油羟丙基-β-环糊精包合物中反式-橙花叔醇的方法。[方法]色谱柱:D iam onsil C18(250×4.6m m,5μ);流动相∶甲醇-水(85∶15);流速:1.0m L/m in;检测波长:210nm;柱温30℃。[结果]反式-橙花叔醇线性范围为0.1×10-5～0.6×10-3μL,r=0.9999,加样回收率为102.62%,R SD为1.314%(n=9)。[结论]本方法简便、快速,精密度、重现性好,可以作为降香挥发油羟丙基-β-环糊精包合物的质量控制方法。

二香合心软胶囊中橙花叔醇的含量测定

目的建立二香合心软胶囊中橙花叔醇的含量测定方法。方法反相高效液相色谱法,采用KromasilODS-1色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),以甲醇-水(78∶22)为流动相,测定波长为213nm。结果橙花叔醇在50.4～504mg·L-1质量浓度范围内与峰面积之间线性关系良好,r=0.9994,回收率为100.2%,RSD为1.5%。结论方法简便、快速、准确,可作为控制二香合心软胶囊生产工艺和产品质量的方法。

液相色谱串联质谱法测定大鼠血浆中反式-橙花叔醇质量浓度

目的建立测定大鼠血浆中反式-橙花叔醇质量浓度的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法,并用于药代动力学(PK)研究。方法大鼠灌胃50 mg/kg反式-橙花叔醇,给药后特定时间点采血,以磺胺甲噁唑为内标,血浆样品采用乙腈沉淀蛋白处理。色谱柱为Synergifusion-RPC_(18)柱(50 mm×3.0 mm,4μm),流动相为乙腈-含0.1%甲酸和1 mmol/L乙酸铵的水溶液(40∶60,V/V),流速为400μL/min。采用电喷雾离子源,正离子模式,多反应监测模式。建立标准曲线,计算血药浓度,根据血药浓度建立血药浓度-时间曲线,并计算主要PK参数。结果含药血浆标准曲线的质量浓度线性范围为0.01~40μg/mL,相关系数(r)为0.9972(n=10);定量下限为0.01μg/mL;反式-橙花叔醇日内精密度试验的RSD≤6.20%,日间精密度试验的RSD≤7.67%;提取回收率≥(91.28±4.94)%。反式-橙花叔醇在大鼠血浆中稳定性良好,主要PK参数峰浓度(C_(max))为(21.38±3.08)μg/mL,半衰期(t_(1/2))为(1.950±0.346)h,0~t药时曲线下面积(AUC_(0-t))为(52.62±10.37)μg/(mL·h),表观分布容积(V_(Z/F))为(2.660±0.333)L/kg,0~t平均驻留时间(MRT_(0-t))为(2.650±0.341)h。结论所建立的LC-MS/MS法准确、可靠,可用于大鼠血浆中反式-橙花叔醇的质量浓度测定及其PK研究。

HPLC法同时测定冠心丹参胶囊中丹参酮ⅡA和橙花叔醇的含量

目的：建立一种HPLC方法同时测定冠心丹参胶囊中丹参酮ⅡA和橙花叔醇的含量。方法：采用HPLC法，色谱柱为Kromasil—C18（4．6mm×250mm，5um）柱，流动相：以甲醇-水（80：20，v：v）为流动相；流速：1．0mL／min；柱温：30℃；检测波长：280nm（0～18．5分钟）→213nm（18．5～25分钟）。结果：丹参酮ⅡA和橙花叔醇线性范围分别为1．656～13．248ug／mL（r=0．99999）和12．76～102．08ug/mL（r=0．99997），平均加样回收率分别为98．70％（RSD=0．66％）和98．21％（RSD=1．53％）。结论：新建方法简便、准确、易行，可用于控制冠心丹参胶囊制剂质量。

HPLC法测定枇杷叶中一种橙花叔醇苷的含量

目的：建立HPLC法测定枇杷叶中倍半萜苷—橙花叔醇苷的含量。方法：采用HPLC法测定,色谱柱为Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm,5μm）;流动相为乙腈-水（29∶71）;体积流量1.0 ml/min;柱温30℃;检测波长210nm。结果：倍半萜苷在0.009 629~2.006μg/ml（r=0.999 6）范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为96.23%。结论：该方法操作简单,结果准确,专属性好,可用于枇杷叶的质量控制。

细胞凋亡调控因子BCL-2促进工程酵母合成橙花叔醇

工程酵母菌发酵过程中因氧化胁迫、蛋白质错误折叠等压力致使生产能力降低。该研究发现,在甲羟戊酸途径增强的酵母工程菌中,过表达人源细胞凋亡调控因子B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)和还原型谷胱甘肽合成酶(glutathione synthase,GSH1)编码基因可以促进橙花叔醇的合成,橙花叔醇摇瓶产量分别提高77.7%和32.7%,达到594.1和446.9 mg/L。对表达和未表达BCL-2蛋白的菌株进行代谢组学分析,发现了182种差异代谢物,主要涉及脂肪酸代谢、氨基酸代谢以及辅酶A和泛酸的生物合成等。此外,发现连接有内质网定位信号肽的BCL-2蛋白对工程菌产橙花叔醇的促进作用更强,橙花叔醇摇瓶产量进一步提高了29.2%,达到767.6 mg/L。该研究为提高外源萜类化合物在工程酿酒酵母中的产量提供了一个有效的策略。

辛烯基琥珀酸短链葡聚糖包埋橙花叔醇的研究

以酶解后的蜡质玉米淀粉与辛烯基琥珀酸酐进行酯化反应得到改性的辛烯基琥珀酸短链葡聚糖(octenyl succinic acid short chain glucan,OSA-SGC),对橙花叔醇进行包埋,并探究橙花叔醇在卷烟爆珠的应用效果。运用傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR),热重分析(thermogravimetric analysis,TGA),透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM),动态光散射(dynamic light scattering,DLS)对OSA-SGC和负载橙花叔醇的OSA-SGC进行表征。红外光谱表明,短链葡聚糖(short chain glucan,SGC)经过酯化反应成功制备得到OSA-SGC,橙花叔醇已成功引入到双亲性OSA-SGC疏水性内核。热重曲线表明短链葡聚糖发生酯化反应,包埋橙花叔醇后,热稳定性提高。透射电子显微镜和动态光散射的结论均表明制备得到的样品的粒径属于纳米级颗粒。最后运用气相色谱仪测得取代度不同OSA-SGC对橙花叔醇的包埋率分别为49.45%、53.86%和54.01%。使用感官评价对橙花叔醇和包合物样品的留香时间和香气强度变化进行记录,发现用OSA-SGC包埋橙花叔醇后香气强度变化很小,且3周之后仍有较强的香气存在。

RP-HPLC测定降香煎剂中橙花叔醇含量及变化

目的:建立对降香中橙花叔醇含量随煎煮时间变化的分析方法。方法:采用高效液相色谱法,以甲醇:水为流动相(78:22),检测波长:213nm,体积流速:1.2ml/min,柱温:室温,检测降香沸水后下时每间隔1 min所取水煎液样品中橙花叔醇的含量。结果:在煮沸后20min内,橙花叔醇含量呈上升趋势,在2.8min时达到相对高点;之后,呈下降趋势。结论:沸腾后仍用文火继续煎煮约2.8min时降香中的橙花叔醇的含量相对较高。

HPLC法测定降香油中反式-橙花叔醇含量

目的:建立HPLC法测定降香油中反式-橙花叔醇含量的方法。方法:采用迪马DiamonsiLTMC18色谱柱(5μm,250mm×4.6mm);以甲醇-水(15:85)为流动相;流速为1.0mL.min-1;检测波长为213nm;柱温:30℃。结果:反式-橙花叔醇在0.10～1.0mg.mL-1浓度范围内线性关系良好(r=0.9998),平均加样回收率(n=9)为99.3%,RSD为0.9%。结论:所建立的方法准确、快速,操作简便,可用于降香油的质量控制。

茶树橙花叔醇合成酶CsNES基因两个可变剪接转录本的功能分析

茶树橙花叔醇合成酶CsNES是催化(E)-橙花叔醇生物合成的关键酶。基于茶树全长转录本及基因组数据分析显示,橙花叔醇合成酶基因CsNES除全长转录本外,还存在两个较短的可变剪接基因亚型。利用5′RACE方法验证了CsNES基因分别在第二、三个外显子上存在可变的转录起始位点,并命名为CsNES-2和CsNES-3。体外蛋白重组显示,CsNES-2和CsNES-3表达产物均能够催化底物法尼基焦磷酸FPP生成(E)-橙花叔醇。基因表达分析显示,CsNES-2和CsNES-3在花中的表达量较高,在叶片中的表达水平较弱,而在嫩叶中的表达水平显著高于成熟叶片。在激素GA和MeJA处理下,CsNES-2和CsNES-3能够被MeJA诱导并上调表达。结果表明,CsNES基因存在5′端可变剪接事件,且其可变剪接产物具有催化活性,这为后续研究基因可变剪接机制对茶树萜类代谢的调控有重要指导意义。