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题名基于环介导等温扩增技术检测橡树疫霉菌
被引量:18
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作者
戴婷婷
陆辰晨
沈浩
王源超
郑小波
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机构
南京农业大学植物保护学院卵菌与真菌分子生物学实验室
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出处
《南京农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第3期23-28,共6页
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基金
国家公益性行业(农业)科研专项(200903004)
国家863计划项目(2012AA101501)
农业部948项目(2010-C17)
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文摘
应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了基于颜色判定的简单、快速和灵敏的橡树疫霉菌(Phytophthora ramorum)检测方法。以ITS为靶序列对橡树疫霉菌的分子检测存在无法区分近似种的问题,笔者在橡树疫霉菌的基因组研究中,发现了PrA3aPro类转座子序列。生物信息学分析表明,该序列非常适合作为大豆疫霉分子检测的靶标。利用LAMP技术,以PrA3aPro为靶序列,设计LAMP特异性引物,建立LAMP反应体系与条件,并进行灵敏度和特异性试验。结果表明:整个检测过程仅需1 h,即可通过肉眼直接目测试验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,然后经3种方法验证扩增结果:1)浊度仪验证浊度变化;2)琼脂糖凝胶电泳验证;3)在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定。特异性试验中,在橡树疫霉菌株中能够产生浊度曲线,扩增到梯形条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而在其他疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象。在灵敏度试验中,PrA3aPro-LAMP技术最低检测限为1 ng.μL-1。该方法的建立为橡树疫霉菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。
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关键词
橡树疫霉菌
环介导等温扩增
PrA3aPro
羟基萘酚蓝(HNB)
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Keywords
Phytophthora ramorum
loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
PrA3aPro
hydroxynaphthol blue (HNB)
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分类号
Q93-331
[生物学—微生物学]
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