橡胶树白粉菌分生孢子DNA的微量提取方法建立

由橡胶树白粉菌(Erysiphe quercicola)引发的橡胶树白粉病是我国天然橡胶产业中的一个重要病害,其对乳胶产量造成了严重威胁。随着预测预报技术的不断进步,结合qPCR检测和孢子捕捉技术有望成为高效预测白粉病流行的新方法。本研究针对橡胶树白粉菌分生孢子DNA的微量提取,通过比较不同预处理方式、不同材质的研磨珠以及不同类型的研磨装置,筛选出了最适合的孢子样品研磨体系。进一步比较了CTAB法与几种商业提取试剂盒的提取效率,最终确定了一种可行的孢子DNA微量提取方法:将白粉菌分生孢子水溶液置于4℃超声处理10 min后加入2 mm氧化锆珠0.2 g、0.4~0.6 mm玻璃珠0.2 g以及0.2 mm氧化锆珠0.2 g,用组织研磨仪在4℃70 Hz条件下研磨40 s,停10 s,20个循环,最后使用CTAB法提取DNA。通过qPCR定量,可以在101个/mL的孢子悬浮液当中检出橡胶树白粉菌DNA,且不受田间复杂情况的干扰,具有高灵敏度和强特异性,为橡胶树白粉病的预测预报提供了可靠的理论依据和有效的技术手段。

橡胶树白粉菌保守效应蛋白致病机制研究

白粉菌可侵染多种重要作物,而橡胶树白粉菌(Erysiphe quercicola)引起的橡胶树白粉病严重威胁天然橡胶产业。为探究橡胶树白粉菌致病分子机制,前期对橡胶树白粉菌HO-73菌株进行基因组测序分析,预测出133个潜在的效应蛋白(candiate secreted effector proteins, CSEPs),这类CSEPs仅在白粉菌群中具有同源蛋白。本研究鉴定了其中一个在橡胶树白粉菌中较为保守的效应蛋白—CSEP02974。利用酵母系统测定信号肽功能的试验表明,CSEP02974为分泌蛋白。利用农杆菌介导的本氏烟草转化,瞬时表达CSEP02974-GFP,并进行烟草中的定位分析,结果显示CSEP02974是一个细胞质效应蛋白。进一步在拟南芥表达CSEP02974可抑制几丁质和flg22诱导的活性氧(ROS)爆发和胼胝质积累,表明CSEP02974是白粉菌抑制植物免疫的毒性因子。通过喷施外源双链RNA,使橡胶树白粉菌中CSEP02974基因沉默。致病性分析表明,沉默该基因会导致病菌扩展侵染受抑制。综上,本研究鉴定到保守的橡胶树白粉菌致病因子,为进一步了解橡胶树-白粉菌的相互作用机制提供新的线索。

橡胶树与白粉病菌Oidium heveae亲和互作组织细胞学研究

白粉病是橡胶树生产中最重要的病害之一,是由粉孢属病菌Oidium heveae Steinm.引起。目前,对该病原菌在寄主中侵染行为及其与寄主互作的组织细胞学尚缺乏系统研究。本文利用显微技术,结合多种染色方法,观察了橡胶树白粉菌侵染橡胶树叶组织的细胞学变化及寄主的抗性反应。O.heveae在寄主上发育要经历5个关键发育时间点,即分生孢子萌发高峰(4hpi)、附着胞形成高峰(8hpi)、侵入结构(初生吸器)形成高峰(15hpi)、次生菌丝形成高峰(24hpi)、分生孢子梗形成高峰(5dpi);分生孢子萌发侵入寄主前,其能量来自自身贮存的能量物质。在互作过程中,病原菌初生吸器形成之后,橡胶树叶组织开始出现明显的氧暴发、胼胝质和乳突等抗性反应,活性氧在橡胶树与病原菌互作中起到了重要的作用,当橡胶树叶片中活性氧积累较低时,有利于O.heveae的发育及入侵,活性氧积累较高时,则引发寄主氧暴发等以阻止病原菌进一步扩展。O.heveae在寄主上发育的5个关键发育时间点分别属于病原菌侵染前期、潜育期和侵染后期,橡胶树叶组织早期亲和互作与中后期非亲和互作保持了专性寄生菌与寄主间发育平衡的进化关系。

橡胶树白粉菌分生孢子萌发条件及存活时间的研究

对橡胶树白粉菌分生孢子在不同温度、pH值、光照、湿度和碳源条件下的萌发率进行了研究.结果表明,分生孢子萌发的适宜温度范围为23～28℃,最适温度25℃;适宜的pH范围为6～8;在连续黑暗的条件下分生孢子萌发率最高;不同的湿度对分生孢子的萌发的影响无明显差异;分生孢子在麦芽糖中萌发率最低.在保湿和自然条件下,测定白粉菌分生孢子在4、10、20、23、28℃存活时间,结果表明,保湿条件下白粉菌孢子存活时间较自然条件下长,温度对孢子存活时间有很大影响,4℃下白粉菌分生孢子9d后还有存活的孢子,而28℃下白粉菌分生孢子6d后就全部死亡.

橡胶树白粉菌收集及DNA和RNA提取方法比较

橡胶树白粉菌(Oidium heveae)是专性寄生的病原真菌,难以获取足量和纯度高的菌体,因而不易提取到足够多和质量高的核酸,阻碍了该菌的分子生物学研究,目前关于橡胶树白粉菌核酸提取方法少有报道。采用软毛笔刷取和醋酸纤维乙酯撕取两种方法收集白粉病菌。在尝试使用常规的菌物RNA提取方法基础上,通过优化操作步骤、方法等,研究出改良的Trizol法,用该法能高效率提取到纯度高的橡胶树白粉菌RNA。比较不同DNA提取方法的效率,推荐使用得率高、纯度好的OMEGA FungalDNA kit提取法,用于提取橡胶树白粉菌的DNA。

橡胶白粉菌(Oidium heveae Steinmann)基因组DNA的提取方法

比较了2种菌源、3种方法提取橡胶树白粉病病原真菌橡胶白粉菌(Oidium heveae BA.Steinmann)基因组DNA的效果。结果表明:无论采用单斑分离法收集还是直接收集橡胶白粉菌菌体,无论采用石英砂振荡破壁法、氯化苄法还是尿素法提取,均能获得满足常规分子生物学操作要求的基因组DNA;在基因组DNA的提取产率、完整性方面,各种方式之间略有差异,但无显著差别;2种来源菌体的基因组DNA的ITS序列分析结果一致,说明在无法进行单斑分离的情况下,可以利用直接收集的菌体提取基因组DNA。

SGT1正调控橡胶树白粉菌在拟南芥上激活的抗病性

通过在拟南芥野生型Col-0和突变体sgt1b、eds1上接种橡胶树白粉菌Oidium heveae HN1106,分析了白粉菌细胞进入率、叶片发病症状、菌丝生长状态、细胞死亡和活性氧产生等表型。结果表明,与野生型Col-0相比,橡胶树白粉菌在拟南芥sgt1b上激发的早期抗病性、后期抗病性以及抗病反应部分降低,暗示着SGT1在稳定识别橡胶树白粉菌的抗性蛋白方面发挥着非常重要的作用。

假臭草和九里香甲醇提取液对橡胶树白粉病菌抑菌活性的测定

为筛选防治橡胶树白粉病安全有效的植物源杀菌剂,采用孢子萌发抑制法测定22种植物甲醇提取液对橡胶树白粉病菌孢子的抑菌活性。结果表明,假臭草和九里香提取液浓度在0.1 g/mL时,对橡胶树白粉病菌孢子的萌发抑制率分别为43.98%和47.62%,极显著优于其它植物和对照。进一步测定假臭草和九里香提取液的EC50和EC75值,以及其盆栽试验的防治效果与橡胶树叶片丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性。结果表明,假臭草和九里香对病原菌孢子的EC50值分别为0.26 g/mL和0.20 g/mL,EC75值分别为1.12 g/mL和0.99 g/mL。假臭草和九里香提取液浓度在EC75值时,防病效果分别为20.00%和18.67%,显著高于对照。假臭草和九里香提取液处理后,橡胶树叶片的MDA含量极显著低于对照,CAT、SOD和PAL活性则显著或极显著高于对照。由此可见,假臭草和九里香提取液不仅能抑制病原菌的萌发和生长,而且能提高橡胶树的抗病性。

橡胶树白粉菌诱导寄主及非寄主植物产生活性氧积累的研究

采用DAB染色法观察了橡胶树、马占相思、芒果树和假败酱等植物叶片在接种橡胶树白粉菌后不同时间点的活性氧的积累和白粉病菌的侵入情况。结果表明,橡胶树叶片在接菌后24 h才能检测到微弱活性氧的积累,接菌后48 h活性氧的积累量略有增强,接菌后72 h达到最大强度,之后减弱,接菌后120 h白粉病菌产生分生孢子并且成功侵入叶片组织。马占相思叶片接菌后白粉菌与植物叶片互作的整个过程中活性氧变化规律与橡胶树观察结果相同,接菌后24 h出现活性氧积累,此后随时间的变化活性氧积累先增强后减弱,120 h白粉菌可以产生分生孢子并顺利侵入叶片组织。芒果树叶片接菌后12 h即可检测到大量的活性氧产生,整个互作过程中,活性氧积累量大,接菌后120 h时白粉菌虽然可以产生分生孢子,但未能导致芒果叶片发病。假败酱叶片接种白粉菌后,接菌后12 h可观察到强烈的活性氧积累,随时间的变化染色程度不断加深,染色斑范围扩大,接菌后72 h观察到白粉菌无法继续扩展,最终无法成功侵入叶片组织。观察结果揭示了活性氧,尤其是浸染早期活性氧的积累在植物抵抗白粉病侵染中发挥的重要作用。

橡胶树白粉菌(HO-73)启动子WY172不同长度片段的克隆及表达活性分析

旨在克隆橡胶树白粉菌启动子WY172及其上游2K序列上4个不同长度缺失片段,以分析启动子各片段的表达活性。基于实验室前期研究基础,以WY172上游2K序列作为研究对象进行渐变缺失突变,得到4个不同长度的可能具有启动子活性的片段,结合WY172,选用pBI121载体作为骨架,分别替换GUS基因前的CaMV35S启动子,并分别构建重组表达载体,通过ATMT法转化农杆菌;利用GUS染色法和酶活性检测,分析WY172启动子及不同长度片段的酶活性。分别构建了pBI121-WY172、pBI121-WY172Q、pBI121-WY172Q1、pBI121-WY172Q2、pBI121-WY172Q3共5个重组的植物表达载体,所有植物表达载体烟草瞬时表达GUS染色均有蓝色出现,且蓝色程度均强于阳性对照CaMV35S启动子,其中pBI121-WY172Q3的GUS染色相对最深;GUS酶活性测定结果显示所有缺失突变片段都具有调控基因表达的启动子活性,且启动活性均强于CaMV35S启动子,WY172Q3调控GUS基因表达的活性最高。因此我们判断WY172及其上游2K序列上4个不同长度缺失片段均具有启动子活性,其中以WY172Q3启动子片段的表达活性最强。

橡胶树白粉菌MAPK级联信号途径全基因组鉴定及途径模型建立

从全基因组水平鉴定橡胶树白粉菌(Oidium heveae)的MAPK级联信号途径基因,并对其进行Blast比对、蛋白质结构域及聚类分析,构建橡胶树白粉菌中的MAPK级联途径简图,为深入研究其MAPK级联途径的功能奠定基础。利用橡胶树白粉菌基因组数据库和小麦白粉菌(Blumeria graminis)的同源序列进行比对,获得25个MAPK信号途径相关基因。在橡胶树白粉菌基因组中发现了2个MAPK基因、2个MAPKK基因和5个MAPKKK基因。多重序列比对与保守位点分析表明,橡胶树白粉菌MAPK信号途径的激酶结构域均高度保守。在橡胶树白粉菌中构建Fus3/Kss1MAPK、Hog1 MAPK、Slt2(Mpk1)MAPK 3条MAPK级联途径,为深入探究植物病原真菌MAPK超家族的功能奠定了基础。

ATAF2正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性

橡胶树白粉菌(Oidium heveae)侵染拟南芥野生型Col-0,激发拟南芥的抗病反应。该抗病反应依赖于EDS1(enhanced disease susceptibility 1),EDS1在TIR-NB-LRR(Toll-Interleukin1 Receptor-nucleotide binding-leucine-rich repeat)类抗性基因介导的抗病信号通路中发挥非常重要的作用,但目前还不清楚具体的EDS1上、下游作用元件是什么。为了进一步研究橡胶树白粉菌在拟南芥上激发的抗疾信号通路,本实验室对接种橡胶白粉菌oidium heveae HN1106的拟南芥野生型Col-0进行了RNA-Seq数据分析,结果表明,拟南芥Col-0在接种橡胶树白粉菌4 d后,NAC家族(ATAF1,2 and CUC2,NAM)转录因子ATAF2基因上调表达20倍,并且正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性。另外,笔者通过体外蛋白质pull-down试验和体内原生质体免疫共沉淀试验,发现ATAF2可以直接与EDS1发生相互作用,这为将来进一步阐明EDS1抗病信号通路奠定了很好的基础。

粉锈宁烟雾剂在橡胶树不同物候期对白粉菌抑制作用的差异

粉锈宁烟雾剂在橡胶树不同物候期对白粉菌抑制作用的差异刘素青（云南省热带作物科学研究所·景洪·６６６１００）粉锈宁是一种高效、低毒的内吸杀菌剂。自１９８５年以来，经云南省热带作物科学研究所研究和推广，至今已普遍采用粉锈宁烟雾技术防治橡胶白粉病，收到良好...

启动子探针载体的构建及橡胶树白粉菌启动子筛选鉴定

旨在构建适于快速检测橡胶树白粉病菌(Oidium heveae)HO-73启动子的探针载体。以卡那霉素抗性基因Kan作为报告基因,在pUC19骨架载体,构建获得启动子探针载体pUC19-K,连入CaMV35S启动子做启动子探针载体功能验证;利用启动子探针载体pUC19-K对预测的启动子片段LY1、LY2、LY3、LY4进行筛选鉴定。将CaMV35S启动子连入到启动子探针载体中,得到可检测启动子活性的启动子探针载体pUC19-K;应用生物信息学软件对部分橡胶树白粉菌HO-73全基因组数据预测,得到4个理论上具有活性的启动子序列LY1、LY2、LY3、LY4,利用构建的启动子活性探针载体进行活性比较,卡那耐受性实验检测发现含LY2和LY3的菌株随卡那霉素浓度的升高耐受性更强,最终得到2个活性较强的启动子LY2和LY3。以上结果表明,构建的启动子活性探针载体可以有效、灵敏地用于HO-73强启动子的筛选和启动子活性检测。

效应蛋白OhEF 2正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的感病性

白粉菌通过在植物细胞内形成吸器,产生大量的效应蛋白,从而实现在寄主细胞内的侵染。前期有研究人员对Oidium heveae进行基因组和转录组测序分析,预测出133个潜在的效应蛋白。笔者克隆了其中的一个基因OhEP2(Oidium heveae Effector Protein 2),并构建了OhEF 2基因在拟南芥Col-0背景下的过表达转基因植株。通过接种发现,过量表达OhEF 2可以明显促进拟南芥对橡胶树白粉菌的感病性,但不能提高假单胞菌DC 3000的毒性功能,表明OhEF 2可能只在白粉菌侵染的过程中发挥作用。进一步研究发现,OhEF 2显著降低了橡胶树白粉菌在拟南芥上激发的胼胝体沉积和PR1(Pathogen-Related Gene1)基因表达,这为进一步研究效应蛋白OhEF 2在植物体内的毒性作用机理奠定了基础。

橡胶树白粉病菌在疏水介质表面的侵染特征和RNA提取

将白粉菌孢子接种到石蜡膜(parafilm)介质表面,观察不同温度条件下橡胶树白粉菌(Oidium heveae B.A.Steinmann)菌株孢子在疏水介质上的侵染过程,确定0~24 hpi孢子侵染结构发育特征,提取侵染发育过程白粉菌的总RNA,采用RT-PCK扩增分析18S保守基因并评价其质量。结果表明:橡胶树白粉菌孢子在15~34℃温度条件下接种于parafilm介质表面能萌发并形成附着胞,萌发和附着胞形成的适温范围22~28℃,最适离体诱导温度22℃。孢子在parafilm介质表面0~24 hpi(hour Post moculation)侵染发育过程可分为未萌发(0hpi)、萌发(4 hpi)、附着胞形成(6,8 hpi)和次生附着胞形成(16,24 hpi)等4个阶段;采用改良Trizol方法提取白粉菌孢子侵染发育过程4个阶段总RNA,可满足转录组文库要求,并扩增18S序列,进化分析显示其与白粉菌科物种为同一分支。结果表明,病原菌孢子在22~28℃温度条件下能够在介质表面形成侵染结构,0,4,6,8,16,24 hpi侵染发育阶段总RNA可用于转录组测序分析研究。

3个基因共同参与拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性

通过在拟南芥野生型Col-0和突变体sag101,eds1及pad4上接种橡胶树白粉菌Oidium heveae HN1106,分析了拟南芥早期抗病性和后期抗病性表型。结果表明:与野生型Col-0相比,橡胶树白粉菌在拟南芥突变体sag101,eds1和pad4上激发的早期抗病性、后期抗病性以及抗病反应都显著降低,突变体eds1感病性最强,pad4次之,sag101最弱,暗示着PAD4与SAG101在橡胶树白粉菌抗性方面存在功能互补,三者共同参与了拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性。

WRR4C基因正调控拟南芥对橡胶树白粉菌和豇豆白粉菌的抗病性

橡胶树白粉菌(Oidium heveae)与拟南芥野生型Col-0是一种非亲和相互作用,激发依赖于EDS1(ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1)和PAD4(PHYTOALEXIN DEFICIENT 4)的抗病性,推测TIR-NB-LRR(TOLL INTERLEUKIN 1 RECEPTOR NUCLEOTIDE-BINDING LEUCINE-RICH REPEATS)类抗病基因参与对O.heveae的抗病性。本研究通过筛选针对O.heveae的TIR-NB-LRR类差异表达基因,发现WRR4C(white rust resistance 4 C)基因受O.heveae的诱导上调表达。经过表型分析鉴定,O.heveae可以在2个wrr4c单突变体上形成浓密的菌丝网络和少量的分生孢子。同时,O.heveae在wrr4c突变体上激发的细胞死亡、胼胝体沉积和致病相关基因PR1(Pathogenesis related 1)的表达都显著降低,暗示着WRR4C基因正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性。然而,通过白粉菌细胞进入率测定,WRR4C基因并不参与拟南芥对O.heveae的细胞进入抗性。进一步利用荧光定量PCR分析发现,WRR4C基因受O.heveae的诱导,在侵染后的48 h表达量达到最高,推测WRR4C基因主要在白粉菌细胞进入后发挥抗病功能。另外,通过接种豇豆白粉菌,发现WRR4C基因同时正调控拟南芥对豇豆白粉菌的抗病性。

橡胶树HbLFG2蛋白对植物免疫防卫的调控机理

为探究HbLFG2基因对免疫反应的功能,增强感病蛋白对橡胶树白粉菌(Erysiphe quercicola)抗性影响的认识,以进一步了解橡胶树(Hevea brasiliensis)LFG(LIFEGUARD)蛋白调控的植物免疫机制,将含有HbLFG2基因的质粒转化到农杆菌中,利用农杆菌分别在烟草和拟南芥中进行瞬时转染和永久转染。结果表明,在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和本氏烟草(Nicotiana benthamiana)上组成型表达HbLFG2抑制了细菌flg22(flagellin domain of a synthetic 22-amino-acid peptide)诱导的活性氧迸发和胼胝质积累等免疫反应,作用类似HbLFG1基因。但与HbLFG1不同的是,HbLFG2不能抑制疫霉激发子INF1和药物DTT(dithiothreitol)激发的过敏性反应,却能抑制细胞坏死诱导蛋白(Bax)激发的过敏性反应。综上,基因HbLFG1和HbLFG2都具有负调控植物免疫防卫反应的功能,但两者作用的机理不完全一致。

高温胁迫下橡胶树白粉菌实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选出合适的内参基因,构建高温胁迫下不同生长发育时期橡胶树白粉菌基因表达的RT-qPCR体系。利用实时荧光定量PCR技术对EF1、GAPDH、CH、H3、PBS2、TUB、CU 7个候选内参基因进行表达水平测定,并结合△Ct法、GeNorm、NormFinder和Refindre对其进行表达稳定性分析。分生孢子时期基因表达稳定性为EF1>H3>PBS2>TUB>GAPDH>CH>CU,萌发期为GAPDH>EF1>PBS2>CH>TUB>H3>CU,侵染期为EF1>GAPDH>PBS2>H3>TUB>CU>CH,在菌丝生长期和产孢期,基因的表达稳定顺序分别为EF1>GAPDH>CH>H3>CU>TUB>PBS2和EF1>GAPDH>H3>PBS2>CU>TUB>CH。综上所述,EF1基因可以作为高温胁迫对橡胶树白粉菌基因表达的理想内参基因。本研究结果为高温胁迫下橡胶树白粉菌相关基因的表达研究提供了合适的内参基因。