1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解广东地区猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的流行情况并探究其分子生物学特征。【方法】采集广东某猪场疑似猪流感病毒感染猪的鼻拭子和肺脏组织样品进行病毒分离鉴定、遗传进化和关键氨基酸位点分析。【结果】样品经实时荧光定量RT-PCR检测为猪流感病毒核酸阳性;在红细胞凝集试验中,该病毒对鸡红细胞有凝集作用,血凝效价为1∶128;8个基因片段序列结果经BLAST比对和进化树分析显示,HA、NA基因属于欧亚类禽猪流感病毒(H1N1)分支,PA、PB 1、PB 2、NP和M基因属pdm/09分支,NS基因属于北美三源重组分支,因此,本试验分离株属于G4基因型欧亚类禽猪流感病毒,将其命名为A/swine/Guangdong/CJM2/2022(H1N1)。关键氨基酸位点分析显示,分离株HA蛋白裂解位点序列为PSIQSR/GL,具有典型低致病性流感病毒的分子特征。HA基因在受体结合位点处的190、225、226位氨基酸分别为D、E、Q,表明其既具有结合人型唾液酸受体的潜能又具有结合禽型唾液酸受体的潜能。NA基因关键氨基酸残基均未发生突变,提示分离株对奥司他韦和扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂的敏感性较高,而M基因3处氨基酸位点突变为V27A、A30T、D44A,提示对金刚烷胺类药物耐药性增加。【结论】本研究分离鉴定的毒株为G4基因型欧亚类禽猪流感病毒,关键氨基酸位点分析提示该毒株具有适应在哺乳动物中复制和毒力增强的特征。本研究结果为广东地区猪流感的防控提供了参考数据。

欧亚类禽猪流感病毒病原学研究进展

欧亚类禽猪流感病毒被认为是引起下次流感大流行可能性最大的动物流感病毒之一。1979年,第一次在猪群中分离到欧亚类禽猪流感病毒,该病毒随后在欧洲流行。欧亚类禽猪流感病毒从2005年起在我国猪群中广泛存在,偶尔可突破种属屏障感染人;在江苏、河北和湖南等地区已出现人感染欧亚类禽猪流感病毒,由此对公共卫生和生猪养殖业均有一定的威胁和影响。本文综述了欧亚类禽猪流感病毒的流行情况、病原学特征及其相关致病分子机制研究进展,旨在为欧亚类禽猪流感病毒的风险评估提供科学依据。

PB2蛋白T271A突变增强了欧亚类禽猪流感病毒在小鼠中的致病力

目前,欧亚类禽猪流感病毒(Eurasian avian-like H1N1 swine influenza viruses,EA H1N1 SIVs)在我国猪群中广泛流行,同时可跨越种属屏障感染人。PB2-T271A是H5N1、H7N9和2009年甲型H1N1流感病毒中关键的分子标记,可增加病毒在小鼠中的致病力。但是,PB2-T271A对EA H1N1 SIVs的影响尚不清楚。在本研究中,我们分析了PB2-T271A突变对EA H1N1 SIVs在细胞和小鼠中复制能力的影响。本研究发现,PB2-T271A突变增加了EA H1N1 SIVs在哺乳动物细胞和禽细胞中的复制能力,增加了EA H1N1 SIVs在小鼠中的致病力。此外,PB2-T271A突变增加了EA H1N1 SIVs的聚合酶活性。因此,我们应该加强对EA H1N1 SIVs中PB2-T271A位点的监测。

欧亚类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的表达及免疫原性评估

【目的】表达欧亚类禽型(eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)的血凝素(HA)蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013(H1N1)(ZJ245)的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),将其转染293T细胞,采用间接免疫荧光(IFA)检测和Western blot检测HA蛋白在体外的表达;将重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)经肌肉注射途径、以100μg/只剂量免疫16只6周龄BALB/c小鼠(I组和II组),间隔3周后进行加强免疫(二免);同等数量的小鼠以相同方式注射100μL无菌PBS作为非免疫对照组(III组和IV组)。首免和二免每周采血,分别采用血凝抑制(HI)试验和病毒中和(VN)试验两种方法测定不同类型的血清抗体效价;二免2周后,其中两组小鼠(I组和III组)用50μL(106.0EID50)的ZJ245病毒经滴鼻感染途径进行攻毒,另外两组(II组和IV组)用A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)(HLJ44)病毒进行攻毒。攻毒后14 d内每天观察小鼠的临床症状、统计发病与死亡情况,且每天称量小鼠体重,在体重下降比率超过25%时判定为小鼠死亡。攻毒后第3天,每组随机剖杀3只小鼠,分别采集脑、鼻甲、肺、脾和肾等脏器,匀浆处理后通过接种10日龄的非免疫鸡胚测定脏器的病毒含量。通过小鼠体重变化以及脏器滴定的病毒含量评估重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫保护效果。【结果】经酶切鉴定和测序验证表明ZJ245的HA基因的已正确克隆至真核表达质粒p CAGGS中获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),经体外转染293T细胞后,IFA和Western blot证实了病毒的HA蛋白能够正确表达,并具有良好的生物学活性;小鼠的免疫与攻毒试验结果表明,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)首免后一周可检测到针对同源病毒ZJ245的低水平HI和VN抗体,加强免疫后抗体水平明显升高,HI抗体达到76.88、VN抗体达到152.5;同时针对异源病毒HLJ44也产生了较低水平的HI和VN抗体。106.0 EID50的同源病毒ZJ245攻毒时,与非免疫组小鼠相对比,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫完全阻止了因病毒攻击而导致的小鼠体重下降以及肺脏和鼻甲内病毒的复制;106.0 EID50的异源病毒HLJ44攻毒时,相比非免疫组小鼠,质粒免疫组小鼠体重的下降比率、以及肺脏和鼻甲内的病毒滴度均显著降低(P<0.0001、P <0.001、P <0.05)。【结论】重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)能够有效表达病毒HA蛋白,免疫后可使小鼠获得完全抵抗ZJ245感染及部分抵御HLJ44感染的免疫保护力,表明重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)具有良好的免疫原性。

欧亚类禽H1N1猪流感病毒研究进展

猪作为“流感病毒的混合容器”可以感染不同亚型的流感病毒,其中H1N1亚型在猪群中最为流行。可分为欧亚类禽H1N1猪流感病毒(Eurasian avian-like H1N1,EA H1N1)、经典猪流感病毒(Classical swine H1N1,CS H1N1)和2009年大流行H1N1病毒(2009 Pandemic H1N1,2009/H1N1)等。EA H1N1猪流感病毒自出现后便开始在欧洲和亚洲地区的猪群中快速传播,逐渐取代了当时流行的CS H1N1猪流感病毒。部分地区存在不同亚型的猪流感病毒或不同基因型的EA H1N1猪流感病毒共同传播的现象,特别是当2009/H1N1猪流感病毒出现后,为其重组提供了更多可选择的基因片段,增加了其发生重组的概率,其中G4基因型的EA H1N1猪流感病毒在哺乳动物中可表达出更强的适应性,成为优势基因型。通过氨基酸位点的突变,EA H1N1猪流感病毒实现了自身的进化,如病毒复制效率提高、毒力增强、突破物种屏障传播或耐药性的产生等,使现阶段针对其防治的手段受到牵制,多种因素共同奠定了其在传播中的主要地位,具有造成下一次流感大流行的潜力。阐明了EA H1N1猪流感病毒能够在传播过程中占据主导地位的原因,指出现阶段防治手段的局限性,并指出在以后的研究中应重点关注其在不断突破物种屏障传播时,通过基因片段的重组和关键氨基酸位点的突变而获得的适应性优势,以期为EA H1N1猪流感病毒的进一步研究提供相应的依据。

陕西省首例人感染G4基因型欧亚类禽H1N1猪流感病毒基因特征分析

目的分析陕西省首例人感染G4基因型欧亚类禽H1N1猪流感病毒(EA H1N1 SIV)的基因特征。方法采集患者咽拭子标本,接种MDCK细胞进行病毒分离获得毒株,采用全基因组深度测序方法获得分离株的8个基因节段序列,通过GenBank数据库中Blast程序进行核苷酸同源性分析,构建系统进化树,分析病毒基因特征。结果病例咽拭子标本经实验室确诊为EA H1N1 SIV,后分离毒株命名为A/Shaanxi-Weicheng/1351/2022(H1N1v)。同源性分析显示,该分离株的PB2、NP、HA、NA和M基因均与A/swine/Beijing/0301/2018(H1N1)核苷酸同源性最高,分别为98.29%、98.73%、97.41%、97.52%和99.08%。进化树显示,该分离株属于G4基因型EA H1N1 SIV,其中PB2、PB1、PA、NP和M基因来自pdm/09 H1N1,HA和NA基因来自EA H1N1,NS基因来自三源重配H1N1。其HA蛋白裂解位点为IPSIQSR↓G,为低致病性流感病毒的分子特征。NA蛋白未出现与神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变。PB2蛋白701N、PA蛋白P224S突变、NP蛋白Q357K突变、M蛋白P41A突变和NS蛋白92D均说明其对哺乳动物的适应性增强。结论该患者为陕西省首例人感染G4基因型EA H1N1 SIV病例,该病毒为低致病性,但其对哺乳动物的适应性增强,需要加强对此类SIVs的监测。

云南省首例人感染G4基因型欧亚类禽H1N1猪流感病毒病原学特征分析

2020年云南发现了首例人感染G4基因型欧亚类禽H1N1(EA H1N1)猪流感病毒,针对分离到的A/YunnanMengzi/1462/2020(H1N1v)病毒分析其血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)氨基酸变异位点、生物学耐药、受体亲和力及抗原性变异特征,并对2020-2021年度季节性流感疫苗对该病毒的交叉保护效果进行评价。结果显示,EA H1N1猪流感病毒A/Yunnan-Mengzi/1462/2020(H1N1v)与世界卫生组织推荐的疫苗株A/Hunan/42443/2015(H1N1v)HA和NA氨基酸位点同源性分别为97.9%和97.4%;A/Yunnan-Mengzi/1462/2020(H1N1v)病毒对神经氨酸酶抑制剂敏感,以结合人流感病毒唾液酸受体α2,6为主,与疫苗株抗原性存在8倍以上差异。接种季节性流感疫苗的儿童、成人和老年组人群针对季节性流感疫苗株A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019(H1N1pdm)抗体滴度≥40者占比分别为80.0%、76.7%和63.3%;而对A/Yunnan-Mengzi/1462/2020(H1N1v)抗体滴度仅为13.3%、26.7%和6.7%。本研究提示接种季节性流感疫苗后产生的抗体对G4基因型EA H1N1病毒不能提供有效保护,该病毒与目前EA H1N1病毒疫苗株在氨基酸位点和抗原性上存在显著差异,并且保持了结合人流感病毒唾液酸受体的特性,研究结果提示需要构建新的疫苗株。

云南省2例人感染欧亚类禽H1N1猪流感病毒分子特征分析

目的 回顾性分析云南省2例人感染欧亚类禽H1N1猪流感病毒(Eurasian avian-like H1N1 swine influenza viruses,EAH1N1 SIVs)分子特征及遗传进化特征,为流行性感冒(流感)防控提供科学依据。方法 对2015年云南省流感监测网络实验室从流感样病例标本中分离到的2株EAH1N1 SIVs毒株进行全基因组测序,使用DNAStar、MEGA6.0等软件进行分子特征分析和系统进化树构建。结果 云南省2015年2例人感染欧亚类禽H1N1猪流感病毒株EAH1N1 SIVs A/Yunnan-Wuhua/SWL1869/2015(H1N1)和A/Yunnan-Longyang/SWL1982/2015(H1N1)均与湖南株A/Hunan/42443/2015同源性较高,同源性分别为97.6%~99.1%和97.9%~99.4%,是EAH1N1 SIVs与A(H1N1)pdm09重配病毒,为G5基因型。受体结合位点分析表明,2株病毒结合α-2,6半乳糖苷唾液酸人受体,为低致病性流感病毒。糖基化位点分析结果显示,2株病毒在HA上有7个潜在的糖基化位点,可能影响与疫苗株抗原的匹配性。耐药性分析表明2株病毒对神经氨酸酶抑制剂药物敏感,但对烷胺类药物耐药。结论 EAH1N1 SIVs对人类健康威胁较大,加强流感监测工作,密切追踪流感病毒的变异情况,能及早发现EAH1N1 SIVs及其他致病性和传播力增强的流感病毒。