欧拉藏绵羊MSTN基因单碱基编辑体系的建立

肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因突变时会导致肌纤维增粗,肌肉细胞增多,表现出双肌性状。为敲除欧拉藏绵羊MSTN基因以获得产肉性状更优的欧拉藏绵羊,利用胞嘧啶碱基编辑系统(CBE)在欧拉藏绵羊MSTN基因编码区提前引入终止密码子。在MSTN基因3个外显子区域上各设计1条sgRNA,分别连接至pEF1a-BE4max-NG-mU6-gRNA-blast质粒并转染欧拉藏绵羊耳成纤维细胞,通过Sanger测序和T-A克隆检测,成功筛选出1条靶向外显子I的符合预期的sgRNA,编辑效率20%。本研究成功通过单碱基编辑技术在欧拉藏绵羊耳成纤维细胞MSTN基因编码区进行定点编辑,为通过分子育种培育产肉性状更佳的欧拉藏绵羊新品种奠定基础。

单碱基编辑系统介导欧拉藏绵羊GDF9、FecB多胎基因的定点突变

本研究旨在利用单碱基编辑系统(single base editing system)实现欧拉藏绵羊成纤维细胞FecB和GDF9基因靶位点A到G和C到T的碱基替换并检测其编辑效率。首先设计合成靶向欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因的sgRNA序列,再分别连接至epi-ABEmax、epi-BE4max质粒,构建载体并电转至欧拉藏绵羊成纤维细胞,最后对阳性细胞FecB和GDF9基因进行Sanger测序鉴定靶位点突变结果,并通过T-A克隆估算单碱基编辑系统的编辑效率。结果显示获得了靶向欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因的sgRNA,并构建使欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因单碱基突变的载体,FecB基因靶位点编辑效率为39.13%,GDF9基因靶位点(G260、G721、G1184)编辑效率分别为10.52%、26.67%和8.00%。本研究运用单碱基编辑系统在欧拉藏绵羊成纤维细胞上实现了FecB和GDF9基因靶位点突变,为改良欧拉藏绵羊一胎多羔的繁殖性状奠定理论基础。

欧拉型藏绵羊血红蛋白多态性研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对河南县77只欧拉型藏绵羊的血红蛋白多态性进行了研究。结果发现,藏绵羊的血红蛋白位点上有HBA和HBB两个等位基因控制的HBAA、HBAB和HBBB三种基因型。其中HBAA和HBA分别为优势基因型和优势等位基因,其频率分别为0.6104和0.799。经χ2适合性检验,欧拉型藏绵羊HB基因型处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。HB位点的基因杂合度为0.3212。

欧拉型藏绵羊GHRHR基因部分片段的克隆及多态性研究

对欧拉型藏绵羊生长激素释放激素受体(GHRHR)基因部分片段进行PCR扩增和克隆测序(GenBank Accession No:EU289218),利用BioEdit7.0.9.0、DnaSP 4.10.9和MEGA4.0等生物信息学软件对该部分序列与GenBank中普通牛、瘤牛、水牛相应序列进行比对分析,并对58只欧拉型藏绵羊该基因片段进行SmaI-RFLP研究。结果表明:欧拉型藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个物种基因序列间同源性大小依次为92.5%、92.0%、91.5%;4个物种间共发现41处序列间碱基差异(9.65/100 bp),其中藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个牛亚科物种均存在差异碱基29处。碱基变异类型主要表现为碱基转换和颠换,少数为碱基插入和缺失。推导的部分氨基酸序列间同源性大小依次为88.8%、88.8%、94.4%。58只欧拉型藏绵羊该基因片段SmaI-RFLP分析均为单态,表现为AA基因型。

欧拉型藏绵羊血清运铁蛋白多态性的研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对欧拉型藏绵羊的74份血样进行了血清运铁蛋白(serumtransferrin,TF)多态性的研究。结果发现,被检欧拉型藏绵羊的血清TF位点上检测出TFA、TFB、TFC、TFD和TFM5个复等位基因,其中TFB、TFC和TFD为优势等位基因,其基因频率分别为0.4122、0.2973和0.2162;发现TFAB、TFAC、TFAD、TFBB、TFBC、TFBD、TFBM、TFCC和TFDD等9种基因型,其中TFBC、TFBB、TFBD、TFCC和TFDD为优势基因型,其基因型频率分别为0.2703、0.1622、0.1622、0.1351和0.1216;TF位点的基因杂合度为0.6921。

藏绵羊GHR基因5′侧翼区序列特征分析

对欧拉型藏绵羊生长激素受体(GHR)基因5′侧翼区(包括P1启动子和外显子1A)进行了T-A克隆和序列测定(GenBank accession No.EF116490),在分析其序列结构特征的基础上与GenBank中摩弗伦羊、山羊、普通牛、欧洲野牛进行了比较基因组学和系统进化研究,结果表明:(1)欧拉型藏绵羊GHR基因启动子P1区存在C/EBP、C/EBPb、SP1、Cap、USF、HFH-2、HNF-3b、Oct-1等多个潜在的转录因子结合位点,可能与GHR基因的转录调控和起始以及特异表达有关。在该非编码序列中,重复序列所占比率为2.55%,不存在SINEs、LINEs、LTR类反转录元件和DNA转座子元件,而发现存在一(TG)11微卫星位点;(2)在启动子P1区,藏绵羊与摩弗伦羊、山羊、普通牛、欧洲野牛各物种间同源性大小分别为99.7%、94.2%、85.9%、86.5%;而在外显子1A区段,藏绵羊与摩弗伦羊、山羊、普通牛、欧洲野牛各物种间同源性大小分别为99.0%、97.0%、92.7%、94.6%。物种间欧拉型藏绵羊与摩弗伦羊同源性最高,而欧拉型藏绵羊与普通牛最低。(3)邻接法(即NJ法)构建的分子系统进化树聚类结果表明,欧拉型藏绵羊与摩弗伦羊先聚为一类,再与山羊聚类形成一个大分支,而普通牛和欧洲野牛先聚类形成另一大分支,两大分支最后再聚为一起,其聚类结果与线粒体DNA和动物学分类的研究结果一致。

冷季牧归补饲精料对高海拔地区藏系绵羊血液生化指标的影响

选取9月龄欧拉型藏系绵羊羯羊(30.21 kg±1.42 kg)40只,随机分为4组,A组冷季放牧,B、C和D组冷季牧归每天每只分别补饲0.10、0.20和0.30 kg混合精料,试验期210 d,研究冷季牧归补饲精料对其血清生化指标的影响。结果表明,补饲精料提高了欧拉型藏系绵羊血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、钙(Ca)的含量,钙/无机磷(Ca/IP)比值及肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和γ-谷氨酰胺基转移酶(GGT)活性;随着精料补饲量增大,绵羊血清葡萄糖(GLU)、胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)含量,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性,生长激素(GH)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、缩胆囊素(CCK)、胃泌素及免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)及免疫球蛋白M(IgM)的浓度增大,但补饲0.30 kg组试验羊IgG浓度较C组略有下降(P>0.05);与A组相比,补饲精料显著提高了试验羊碱性磷酸酶(AMP)活性、尿素氮(BUN)浓度和BUN/CRE的值,显著降低肌酐(CRE)和尿酸(UA)浓度(P<0.05)。综合上述结果,冷季归牧后补饲适量精料可改善欧拉型藏系绵羊能量和脂肪的代谢能力,增强肝脏蛋白合成,提高机体免疫力和抗氧化力,调节钙磷代谢。

藏绵羊GHRH基因部分片段的克隆及HaeⅢ-RFLP分析

对欧拉型藏绵羊生长激素释放激素(GHRH)基因部分片段进行PCR扩增、纯化和克隆测序,利用GenBank中的Blastn方法与普通牛相应基因序列进行了比对分析,并对54只欧拉型藏绵羊该基因片段进行了HaeⅢ-RFLP研究。结果表明:欧拉型藏绵羊与普通牛GHRH基因部分序列间同源性为93%;序列间碱基变异类型主要表现为碱基转换和颠换,亦存在碱基插入和缺失;54只欧拉型藏绵羊该基因片段HaeⅢ-RFLP分析均为单态,表现为AA基因型。

特藏寒杂交绵羊一般抗病力免疫指标的主成分分析

为培育具有较强抗病能力的绵羊新品系,对特藏寒杂交绵羊、欧拉型藏绵羊及特克塞尔羊的7项免疫指标进行了检测,并应用主成分分析法评估了3个绵羊群体的免疫水平。结果表明,特藏寒杂交绵羊与欧拉型藏绵羊在β-defensin及C3bER等2项免疫指标中存在显著相关(P<0.05);多维尺度分析表明,特藏寒杂交绵羊在7项免疫指标中的综合水平不同于欧拉型藏绵羊与特克塞尔羊;主成分分析表明,欧拉型藏绵羊综合得分大于特藏寒杂交绵羊和特克塞尔羊,欧拉型藏绵羊在C3bER、C3bRR及T-AOC等3项指标中均得分显著;特藏寒杂交绵羊在IL-1β、IL-18、β-defensin及Lysozyme等4项免疫指标中得分显著。综上,欧拉型藏绵羊综合免疫水平高于特藏寒杂交绵羊和特克塞尔羊;欧拉型藏绵羊在红细胞免疫能力及总抗氧化能力方面有优势,特藏寒杂交绵羊在促炎性反应及抗菌多肽方面有优势。

“特藏寒羊”群体遗传结构分析与选择信号的对比分析

旨在了解“特藏寒羊”群体遗传结构和优势性能的遗传来源,为配种方案和杂交利用提供依据,帮助组建特定性能的家系。本研究应用SNP 50K v3芯片对50只“特藏寒羊”(公羊18只,母羊32只)、24只特克塞尔羊(公母各半)和48只欧拉羊(藏系绵羊)(公羊20只,母羊28只)进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisim,SNPs)检测;使用Plink、GCTA和MegaX软件对“特藏寒羊”进行遗传结构分析;Tajima’D法对“特藏寒羊”、特克塞尔羊和欧拉羊(藏系绵羊)进行群体内基因组选择信号分析,将“特藏寒羊”的选择信号分别与特克赛尔羊和欧拉羊(藏系绵羊)的选择信号取交集进行GO和KEGG功能富集分析,找到可能影响“特藏寒羊”优势性能的亲本来源和相关基因。结果显示:“特藏寒羊”平均多态信息含量(PIC)为0.26±0.12,平均期望杂合度(He)为0.36±0.14,平均观测杂合度(Ho)为0.37±0.16,平均最小等位基因频率(MAF)为0.25±0.15,平均有效等位基因数(Ne)为1.59±0.07;ROHs长度主要分布在1~5 Mb,占比50.4%,长度20 Mb+的ROH占比9.52%,近交系数F_(ROH)中位数为0.085;遗传距离D值为0.1527~0.3491,平均遗传距离0.2796;NJ聚类分析共划分5个家系,家系内个体分布不均;“特藏寒羊”与欧拉羊(藏系绵羊)交集信号定位的基因与免疫相关,包括原发性免疫缺陷、造血细胞系和T细胞受体信号通路;“特藏寒羊”与特克塞尔羊交集信号定位的基因与生物代谢相关。综上所述,“特藏寒羊”存在一定程度近交,需加强管理;欧拉羊(藏系绵羊)更影响“特藏寒羊”免疫功能,特克塞尔羊更影响“特藏寒羊”生长发育和肉质性状。

甘南欧拉型藏绵羊屠宰性能分析

为了探讨草地型藏绵羊中欧拉型藏绵羊的肉用性能,对饲养在甘南的10月龄、2岁、3岁、4岁和5岁以上年龄段的欧拉型藏绵羊开展屠宰试验,观测分析了主要屠宰性状、肉品质和内脏器官指标。结果表明:不同年龄组欧拉型藏绵羊之间的宰前活重、热胴体重差异极显著(P<0.01),屠宰率在3岁时最高,为49.90%;根据新西兰羊肉分级标准,判定10月龄羔羊组的肌肉分级标准为PL级,即具较好的肉品质。2岁、3岁、4岁和5岁以上组均属于脂肪分级的ML级,属中等脂肪含量。

欧拉型藏羊血清酯酶的多态性研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对66只欧拉型藏绵羊血清酯酶的多态性进行了研究。结果发现:欧拉型藏绵羊血清酯酶位点有ESA和ESa两种表型,以ESA为优势表型(71.21%);ESA和ESa等位基因频率分别为0.46和0.54,其基因杂合度为0.497 3。