‘44号’抗虫黑杨基于根段组培再生和遗传转化体系的建立

[目的]以美洲黑杨和转BtCry1Ac欧洲黑杨的杂交子代‘44号’抗虫黑杨作为试验材料,采用无菌苗根基部为外植体,建立高效稳定的组培再生体系和黑杨遗传转化体系。[方法]以‘44号’抗虫黑杨无菌苗0.5~1.0 cm的根基部为试验材料,研究不同激素配比对根系不定芽的诱导和生根的影响,探索根系对草铵膦的临界耐受浓度,以农杆菌介导法进行遗传转化,并通过β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因染色实时监控和鉴定阳性植株。[结果]筛选出‘44号’抗虫黑杨根系诱导不定芽最优培养基为:WPM+20 g·L^(-1)蔗糖+7.8 g·L^(-1)琼脂+0.25 mg·L^(-1)6-BA+0.05 mg·L^(-1) NAA,分化率为86.67%;不定芽生根的最优培养基为:WPM+0.075 mg·L^(-1) NAA+7 g·L^(-1)琼脂+0.1 g·L^(-1) AC,生根率为75.00%。通过根系草铵膦抗性筛选梯度试验,确定根系对草铵膦筛选最适遗传转化筛选浓度为0.8 mg·L^(-1)。采用农杆菌介导法将外源基因转入到根中,经不定芽诱导和生根两个阶段获得再生植株苗,经特异引物进行PCR鉴定,31个外植体中阳性植株为9株,转化效率为29.0%。[结论]建立了‘44号’抗虫黑杨根系的再生和遗传转化体系,为黑杨派杨树的高效基因转化提供了途径的同时,也为以‘44号’抗虫黑杨为基础,通过转基因技术聚合更多的优良性状,提供了重要的技术支撑。

引种欧洲黑杨无性系苗期生长测定与选择

对引进的59个欧洲黑杨无性系苗期生长性状进行了测定。结果表明,无性系间苗高和地径表现出极显著差异,具有较丰富的遗传变异基础。无性系苗高广义遗传力为84.79%,遗传变异系数为10.55%;地径广义遗传力为79.22%,遗传变异系数为11.8%。以苗高、地径年生长量为指标,应用多性状综合评价法,选出表现好的欧洲黑杨无性系13个,其苗高遗传增益为12.3%,地径遗传增益为12.2%,其中的N8,N51,N48表现特别突出,综合评比超过或接近参照种欧美杨107号,如果选择这3个无性系,则苗高遗传增益可达18.5%,地径遗传增益可达23.5%。

欧洲黑杨转Bt毒蛋白基因植株大田抗虫性测定

近几年，基因工程发展很快，通过基因工程已获得了各种各样的转基因植物，如抗虫转基因农作物的棉花（ＧｏｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ．）、水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）、马铃薯（ＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍＬ．）、玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）、小麦...

TA29-Barnase基因导致抗虫转基因欧洲黑杨雄性不育的研究

取在１／２ＭＳ＋ ＮＡＡ０－０２ ｍｇ／Ｌ 培养基中发育４ ～６ 周的欧洲黑杨转Ｂｔ 基因植株１５ｎ１９２ 试管苗幼叶，在ＭＳ＋ ＢＡ０－２ ｍｇ／Ｌ＋ ＮＡＡ０－０２ ｍｇ／Ｌ培养基中培养１６ｈ ，分别用基因枪法和叶盘法转化ＴＡ２９Ｂａｒｎａｓｅ嵌合基因，其Ｂａｒｎａｓｅ 基因的转化率依次为１６－１ ％ 和２３ ％ ，再生株数分别为１７５／１２ 和７１／１０ 。试验表明，选择发育适宜的叶片，利于目的基因转化后的植株再生。进一步用ＳＤＳ 法提取转基因植株总ＤＮＡ，经ＰＣＲ 检测表明：转化植株基因组中扩增出的ＤＮＡ 片段与Ｂａｒｎａｓｅ 基因的大小一致；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ 分析出转化后的欧洲黑杨基因组中携有Ｂａｒｎａｓｅ 基因片段，进行Ｄｏｔ Ｂｌｏｔ 检测，转化植株有一明显的杂交斑，并证实为阳性转化植株，并通过试管培养，结合林木常规育种方法，获得了转Ｂａｒｎａｓｅ 基因的抗虫欧洲黑杨转基因植株。

不同基因型欧洲黑杨幼苗氮素利用效率差异及其机理初探

以104份欧洲黑杨不同基因型(无性系)为材料,通过生长量和生理指标的测定,研究土壤施氮和不施氮条件下其氮素利用效率的差异。结果表明:不同供氮水平下,不同基因型欧洲黑杨生长差异显著。根据2个供氮水平的苗木年平均材积生长量将欧洲黑杨群体划分为4个类型:双高效型、高氮高效型、低氮高效型和双低效型,并结合氮反应指数在双高效型与高氮高效型中分别筛选出8个氮素利用效率高、生长表现优良的基因型,具较高的育种价值。比较分析欧洲黑杨不同基因型氮素利用效率相关指标,发现双高效型的净光合速率、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性、根系干质量、体积、比表面积均高于高氮高效型,初步揭示了不同类型欧洲黑杨氮利用效率存在差异的机理。

欧洲黑杨转基因稳定性及对土壤微生物的影响

利用PCR分析技术 ,分析了田间试验已达 7a的转Bt基因欧洲黑杨的基因稳定性 ,并对其林地和非转基因林地的土壤微生物进行了类群数量分析。PCR分析表明Bt基因仍然存在于转基因植株中 ,转基因植株与对照杂交后代Bt基因分离呈 1∶1比例 ,符合孟德尔遗传分离规律 ,表明基因仍稳定存在。计数结果表明转基因林地中转基因植株与非转基因植株间根系土壤 3大类微生物 (细菌、放线菌和霉菌 )数量无显著差异 ,转基因林地与非转基因林地 (邻近杨树林地和健杨林地 )间的土壤 3大类微生物 (细菌、放线菌和霉菌 )数量无显著差异 ,说明转基因欧洲黑杨对土壤微生物系统尚没有明显的影响。

SSR标记与欧洲黑杨材性性状的关联分析

对引进的92个1年生和65个4年生欧洲黑杨无性系进行材性测定,并结合171个SSR标记进行材性数量性状位点的关联分析。结果表明:1年生和4年生欧洲黑杨的木材基本密度分别为0.3088g.cm-3和0.3552g.cm-3,纤维长分别为601.3μm和649.4μm,纤维宽分别为21.81μm和23.11μm,微纤丝角分别为26.5°和26.1°。4年生欧洲黑杨苯醇抽提物、综纤维素、α纤维素以及木质素含量分别为2.32%、78.62%、41.48%和20.93%。通过SSR标记位点与性状间的关联分析,共获得与1年生材性性状关联的SSR标记位点10个,其中基本密度3个,微纤丝角5个,纤维长2个,纤维宽4个,贡献率6.43%～23.18%;与4年生欧洲黑杨材性性状关联的SSR标记位点8个,其中基本密度、纤维长、木质素各1个,微纤丝角、综纤维素含量和α纤维素含量各2个,贡献率7.41%～28.56%。

欧洲黑杨优质核心种质库的初步构建

对159份欧洲黑杨种质资源的生长、育种值、材性、养分利用率和水分利用率等13个性状进行分析,采用13种表型选优的抽样方法构建欧洲黑杨优质核心种质库。表型值评价表明:当抽样群体比例达到21.4%以上即能满足构建核心种质要求,而只有抽样群体比例达到30.2%以上SSR分子遗传多样性才能满足构建核心种质要求。最终确定的欧洲黑杨优质核心种质库包含48份种质资源,占原群体的30.2%;与原群体相比,均值和方差不存在显著差异,极差符合率和变异系数变化率分别为97.07%和89.72%;优质核心种质库的有效等位基因数、Nei’s遗传多样性系数和Shannon’s信息指数与原群体之间没有显著差异,保持了原群体的遗传多样性。

欧洲黑杨育种基因资源SSR多态性比较研究

本研究利用13对SSR引物对120份（105份国外引进、15份我国新疆）欧洲黑杨基因资源进行了遗传多态性分析，共检测出171个等位基因，每个多态性位点检测到7～19个等位基因，平均为13．2，多态信息指数为0．396～0．909，平均为0．808；遗传距离为0～0．4564。欧洲黑杨基因种源具有丰富的遗传多样性。通过UPGMA等类分析，将120份材料划分为8类，地理分布较近的材料基本聚在一起，表明遗传距离与地理距离相关性强。

欧洲黑杨基因资源光合生理特征与生长的关系

测定来自欧洲不同地区和我国的108个欧洲黑杨无性系(基因型)气体交换、叶绿素荧光与生长特征参数,研究欧洲黑杨基因资源光合生理与生长性状的遗传变异及相关性。结果表明:欧洲黑杨基因资源内气体交换、叶绿素荧光特征和生长性状具有丰富的遗传变异;来自我国和英国的无性系具有较高的净光合速率(Pn),来自匈牙利的无性系PSII最大光化学效率(Fv/Fm)最高。各检测参数在欧洲黑杨中具有较高的广义遗传力且变异系数较高,气孔导度(Gs)和PSII电子传递速率(ETR)可能是影响欧洲黑杨光合能力的重要限制因素。相关分析结果发现,Pn、胞间二氧化碳浓度(Ci)、Gs和ETR等参数指标在欧洲黑杨光合效率评价中具有潜在的应用价值;起源于塞尔维亚及其他南欧、东欧的欧洲黑杨可在进一步的杨树高光效育种研究中作为优良基因型选择的重点。

新疆额尔齐斯河流域苦杨与欧洲黑杨遗传多样性分析

应用SSR标记技术,对新疆额尔齐斯河流域河谷分布的苦杨(Populus laurifoli)和欧洲黑杨(Populus nigra)天然居群的遗传多样性和遗传分化进行了研究。结果显示:苦杨和欧洲黑杨的天然居群具有较高的遗传多样性,且苦杨明显高于欧洲黑杨。与苦杨居群相比,欧洲黑杨居群间基因流较高,居群间的遗传分化程度较小,变异主要源于居群内。苦杨和欧洲黑杨居群内的杂合度较高,各个居群的各项遗传参数都要小于物种水平。苦杨和欧洲黑杨均偏离Hardy-Weinberg平衡,表现为杂合子过量的现象。

欧洲黑杨花粉母细胞减数分裂观察及其不同步性分析

以欧洲黑杨的雄花枝为材料,采用温室切枝水培和醋酸洋红染色制片法,观察花粉母细胞减数分裂进程及其与花芽发育外部形态的关系。结果表明:(1)欧洲黑杨花粉母细胞的减数分裂进程快慢与温度高低关系密切;(2)减数分裂发生时其花芽的外部形态发育没有明显变化;(3)花粉母细胞减数分裂不同步性突出,同一花药内的花粉母细胞处于不同的减数分裂时期,且同一花芽尖端发育明显滞后于中部和基部;(4)减数分裂过程中有少量的核仁异常现象,虽观察到较多平行纺锤体现象,但未发现天然2n花粉。该研究结果揭示了欧洲黑杨减数分裂的遗传变异规律,为诱变育种、倍性育种以及分子水平的进一步研究奠定了细胞学基础。

抗虫转基因欧洲黑杨苗期光合特性研究

以抗虫转基因欧洲黑杨和非转基因欧洲黑杨无性系对照为研究材料,比较研究了其扦插苗在盆栽条件下苗期的光合生理特性及叶绿素荧光特性的差异,目的是了解外源基因的导入是否对欧洲黑杨的光合作用产生了非预期效应。结果表明:除了Ci和Fv/Fm外,转基因欧洲黑杨和对照在其他光合指标间差异均未达到显著水平。转基因欧洲黑杨和对照的净光合速率(Pn)日变化均表现为双峰曲线,但Pn的峰值大小和出现时间各异,光合"午休"的起始时间及持续时间也不尽相同;经相关性检验表明,转基因欧洲黑杨的Pn与胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)及蒸腾速率(Tr)呈极显著正相关(P<0.01),而对照仅有Gs日变化曲线与Pn日变化曲线基本一致,Ci、Tr与Pn变化趋势并不一致,无相关性;转基因欧洲黑杨的光合"午休"现象主要是由气孔限制因素引起的,而对照的"午休"现象则是气孔因素与非气孔因素共同作用的结果。同时,转基因欧洲黑杨与对照光合-光响应曲线的各项参数中,只有暗呼吸速率(Rd)之间达到了显著性差异(P<0.05),其中,对照要比转基因欧洲黑杨高52.8%,表明对照的生理活性较高。与对照相比,转基因欧洲黑杨表现出随着光强的增加,Fv/Fm值逐渐下降的趋势,14:30左右达到一天的最低值(0.78),说明持续的光照对其叶片PSⅡ最大光化学转化效率产生了一定的抑制作用,至17:00左右并未恢复到早晨的正常水平,表明其光合机构出现一定程度的光化学效率下调。总体来说,外源Bt基因没有对转基因杨树苗期的光合特性产生非预期的效应。

欧洲黑杨分别与川杨和滇杨杂交及其F_1代苗期性状

采用室内切枝水培法开展欧洲黑杨×川杨、欧洲黑杨×滇杨人工杂交实验.结果表明:欧洲黑杨×川杨、欧洲黑杨×滇杨授粉后第10天坐果率分别达92.88%和82.14%,种子发芽率达80%和50%,成苗率达72.5%和65.63%,杂交可配性强;这2个杂交组合当年生杂交苗平均苗高分别为44.3和42.2 cm,平均地径分别为5.50和5.37 mm,生长量非常接近,苗高变异系数分别为14.5%和19.01%,地径变异系数分别为10.7%和16.1%,变异幅度较大;F1代杂种实生苗在苗期主要性状特征表现为多态性.

转Bt基因欧洲黑杨抗虫稳定性及其对天敌昆虫的影响

1997—2001年,对新疆玛纳斯平原林场的转Bt基因欧洲黑杨试验林进行了食叶害虫(杨尺蠖)和杨梦尼夜蛾危害调查,转基因试验林叶片平均损失率均低于10%,试验林地虫口密度由1997年的18头.m-2降低到2001年的8头.m-2,而对照林地虫口密度却呈上升趋势。2005年,位于北京怀柔的转Bt基因欧洲黑杨试验林受杨尺蠖危害,叶片损失率不超过20%,而当地其它杨树林叶片损失率高达90%。在转Bt基因欧洲黑杨林(新疆玛纳斯)中,寄生靶标害虫的天敌种类、数量和寄生率均高于对照林,对从试验林中采集的靶标昆虫的蛹进行接种试验,与对照相比,寄生蜂出蜂率和数量均无明显差异,寄生蜂也无异常,说明转Bt基因欧洲黑杨未对天敌昆虫产生明显不利影响。

欧洲黑杨基因资源材性关联基因的SNP分析

以115个欧洲黑杨(Populus nigra L.)无性系为材料,利用TaqMan技术分析了欧洲黑杨基因资源参与木质素和纤维素合成的酶(4CL、PAL和CesA2)的单核苷酸多态性,并对分型的SNPs与木材材性性状(物理性状:基本密度、纤维长、纤维宽、微纤丝角;化学性状:木质素含量、纤维素含量、α纤维素含量等)进行了相关分析。结果如下:(1)在对4CL、PAL和CesA2等3个基因进行检测时,共获得27个SNPs标记,对其中转换(A-G,C-T)有17个位点,颠换(A-C,G-C,G-T,A-T等)有10个位点;(2)对其中的3个SNPs进行了分型,分别记作SNP1、SNP2和SNP3;(2)对已经分型SNPs位点与材性性状进行方差分析,结果显示,3个SNPs中只有SNP1与4年生欧洲黑杨综纤维素含量显著相关,表现为负效应,贡献率为11.11%;(3)对欧洲黑杨4CL基因的SNP1标记的不同基因型所对应的材性性状进行方差分析,结果显示基因型为CC和CT的欧洲黑杨相对于基因型为TT的欧洲黑杨有较高的纤维素含量。

欧洲黑杨基因资源稳定碳同位素组成特征

通过测定从欧洲不同地区引进的134个欧洲黑杨无性系叶片的稳定碳同位素比率(δ13C值),研究了欧洲黑杨基因资源1δ3C值的特点和水分利用状况。结果表明:(1)引进的欧洲黑杨基因资源叶片δ13C值为-30.40‰^-27.02‰,水分利用效率具有丰富的多样性,优于国内乡土树种,其中来自俄罗斯、土耳其和德国的基因资源1δ3C值明显高于其它国家的基因资源,可为抗旱杨树新品种的选育提供优良的亲本材料;(2)相同基因资源在不同地区栽植时,δ13C值受环境的影响较大。生长在内蒙古地区的欧洲黑杨无性系叶片平均δ13C值为-26.53‰,明显高于在陕西和北京地区测得的-28.39‰和-28.93‰,故在进行不同基因型的δ13C值评价和选择时要在相同条件下进行;(3)生长在不同地区的欧洲黑杨的δ13C值与生长量的相关程度不同,生长在北京地区的欧洲黑杨δ13C值与株高、地径呈极显著正相关(P=0.01),相关系数分别为0.912和0.829,而生长在陕西和内蒙古地区的欧洲黑杨的δ13C值与生长指标虽然也相关,但达不到显著水平。在研究植物生长与水分利用效率之间的关系时,必须结合植物的生长环境进行分析。

一年生转Bt基因欧洲黑杨对土壤微生物的影响

利用PCR技术检测欧洲黑杨植株内转入Bt基因的稳定性,连续1 a对苗期转Bt基因和其林地间及根际土壤中3大类微生物(细菌、真菌和放线菌)进行选择性培养和数量统计分析,并将经过辐射杀菌的转Bt基因欧洲黑杨和其落叶干粉加入培养基,分别对已知细菌、霉菌和放线菌培养并对其数量和生长情况进行了对比分析。结果表明:(1)Bt基因稳定存在于苗期转Bt基因欧洲黑杨植株内。(2)转基因和对照林地间及根际土壤中微生物数量在不同月份无显著差异。(3)转基因植株落叶干粉对已知微生物的培养结果与对照组无显著差异。从而得出:苗期转Bt基因欧洲黑杨林对土壤微生物尚没有明显的影响。

转基因欧洲黑杨中Bt基因表达特性的研究

利用PCR检测了转基因欧洲黑杨当代和杂交后代群体 ,外源Bt基因在 7年生的转基因欧洲黑杨 1 4个无性系中稳定存在 ,Bt基因在杂交后代中分离比例为 1∶1。转基因欧洲黑杨作母本进行杂交时有落花、落果现象 ,可能是基因改造影响了它们的某些生理功能。

水分胁迫下欧洲黑杨无性系生理和生长指标的数量遗传分析

以34个引种欧洲黑杨无性系及107杨、陕林3号2个对照无性系为试验材料,在水分胁迫条件下对无性系的生理和生长指标进行了数量遗传分析。结果表明,不同无性系间及水分处理间在各项生理指标和生长指标上均存在着显著或极显著差异;水分处理间的差异要大于无性系间的差异。数量遗传分析表明,各生长指标的遗传变异系数、表型变异系数和广义遗传力一般均大于生理指标;水分因子对无性系苗期生长具有较大影响,对遗传型的直接选择以生长指标较好。