蓝氏贾第鞭毛虫表面变异抗原反义mRNA的鉴定

目的鉴定编码蓝氏贾第鞭毛虫（简称贾第虫）表面变异抗原（VSP）的正义和反义mRNA。方法采用Trizol法抽提贾第虫单克隆滋养体总RNA,SMART法逆转录合成cDNA。设计合成针对VSPs基因3′端保守区域的特异性引物（内、外引物各1条）,结合SMART引物采用巢式PCR分别扩增得到来源于正义和反义mRNA的cDNA片段。将PCR产物与pGEM-T载体连接并测序,测序结果与GenBank库中的已知序列进行比对。根据测序结果设计特异性引物,以巢式PCR产物为模板,进行正义和反义cDNA的检测。结果巢式PCR显示,VSP正义mRNA和反义mRNA的cDNA均被成功扩增,电泳鉴定扩到产物分别位于0.1~4kb和0.2~2kb。经克隆、测序和序列比对,共获得34个贾第虫VSP编码序列,其中5个来源于正义mRNA的扩增产物,29个来源于反义mRNA的扩增产物,所得VSP编码基因均含有贾第虫VSP mRNA N端变异区和C端特异性保守区。根据5个正义mRNA序列设计的特异性引物在正义mRNA均得到扩增产物,而在反义mRNA仅有4个得到扩增产物。从29个反义mRNA序列中挑选3个设计特异性引物进行PCR,正义mRNA和反义mRNA均得到扩增产物。结论贾第虫VSP基因转录的多个正义mRNA和反义mRNA序列同时存在,该基因存在转录后基因沉默调节机制。