p53正向凋亡调控因子在吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡过程中的作用

目的:研究吉西他滨对人胰腺癌AsPC-1细胞体外生长的作用机制。方法:用脂质体转染法将含有p53正向凋亡调控因子(p53 upregulated modulator of apoptosis,PUMA)反义核酸的真核表达载体pcDNA3.1-PUMAAS和空载体pcDNA3.1导入AsPC-1细胞,G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆。将转染载体的AsPC-1阳性克隆细胞和未转染载体的AsPC-1细胞分别暴露于浓度为1、5、10和15μmol/L的吉西他滨溶液中作用72h。RT-PCR和Western印迹法检测不同组细胞经吉西他滨作用72h后的PUMA表达水平,MTT检测细胞生长抑制情况,FCM、Hoechst 33258荧光染色和TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果:吉西他滨促进AsPC-1细胞凋亡,抑制细胞生长,并有明显的剂量依赖性,在细胞凋亡的同时伴有PUMA表达的上调;当细胞转染PUMA反义核酸抑制PUMA表达后,受吉西他滨作用的细胞中PUMA蛋白表达明显降低,同时伴有细胞凋亡的抑制及细胞增殖明显增加。结论:吉西他滨促进体外AsPC-1细胞凋亡,并抑制细胞生长,其诱导细胞凋亡与上调PUMA表达有关。

微小RNA-221在宣威肺癌细胞中对靶基因p53正向凋亡调控因子调控机制的研究

目的探讨宣威肺癌细胞中微小RNA-221(miR-221)对靶基因p53正向凋亡调控因子(PUMA)的调控机制。方法在宣威肺癌细胞株(XWLC-05)中转染miR-221过表达/抑制表达载体后,将实验分为4组,Control组:未转染任何质粒;Scramble组:转染PUMA质粒;Over-miR-221+PUMA组:转染miR-221过表达载体、PUMA质粒;In-miR-221+PUMA组:转染miR-221抑制表达载体、PUMA质粒。应用实时荧光定量PCR技术检测各组PUMA在mRNA水平的表达差异。荧光素酶报告实验验证PUMA是否为miR221的靶基因。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析miR221对细胞增殖的影响。检测Caspase3/7、9活性分析miR221对细胞凋亡的影响。结果 miR-221可以直接作用于PUMA基因的3’UTR端(t=-8.662,12.761,P<0.001);过表达转染组能够有效地促进宣威细胞增殖,抑制表达转染组能够有效地抑制宣威细胞增殖(24 h:F=98.181,P<0.001;48 h:F=109.561,P<0.001;72 h F=143.782,P<0.001)。在抑制表达转染组中Caspase3/7、9的酶活性是升高的(t=12.851,15.491,P<0.001);而过表达转染组中Caspase 3/7、9酶活性与Control组及Scramble组差异无统计学意义(t=-2.181,P=0.061;t=-2.056,P=0.074);各组PUMA基因的表达差异无统计学意义(H=1.262,P=0.532)。结论 PUMA为miR-221的靶基因之一,miR-221可能通过负向调控靶基因PUMA参与宣威肺癌的发生、发展。

细胞因子在人造血干细胞体外扩增培养中的作用研究进展

自体或异体造血干细胞移植被广泛地应用于临床治疗。因此,将造血干细胞进行体外扩增培养也成为一项极具挑战的实验技术。大量实验证据表明,在体外液体培养体系中加入适当的细胞因子,可以使造血干细胞得以扩增,同时可以调节其生长,即维持静止状态、自我更新、分化、凋亡、在微环境中的迁移等。笔者主要回顾了正向及负向调节细胞因子对造血干细胞体外扩增的作用,总结了几年来使用较多的几种细胞因子组合及造血干细胞体外扩增检测方法。

PUMA基因在胃癌组织及细胞中的表达

目的:研究p53正向细胞凋亡调控因子(PUMA)基因的四种剪接体(PUMA-α,-β,-γ及-δ)在胃癌组织及细胞中的表达特点.方法:应用生物信息学分析PUMA基因四种剪接体的结构特点;同时利用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测胃癌组织、癌旁组织及不同胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901细胞中四种剪接体的mRNA表达水平.结果:PUMA-α和-β在癌旁组织中表达阳性,但在癌组织中表达难以检测,差异显著(t=9.492,15.875,均P<0.05);PUMA-γ和-δ在癌旁及癌组织中均可见表达,且在癌旁组织中的表达量显著高于癌组织(t=4.823,4.056,P<0.05).PUMA-α,-γ及-δ在胃癌不同分化程度的细胞系BGC-823(低分化)及SGC-7901(中分化)中均有表达,但两细胞系间无统计学差异.而PUMA-β在BGC-823中的表达明显高于SGC-7901细胞(t=8.710,P<0.05).结论:PUMA四种剪接体在胃癌组织中的表达下调,与癌的发生呈负相关;PUMA-β的表达还可能与细胞的分化程度有关.

牛磺酸对人肺癌细胞株A549细胞凋亡的影响

目的探讨牛磺酸(Tau)对人肺癌细胞株A549细胞凋亡的作用及其初步机制。方法将A549细胞分为6组:Control组(正常对照组,未给予任何药物处理)和Tau 1组(给予Tau 10 mmol·L^(-1))、Tau 2组(给予Tau20mmol·L^(-1))、Tau 3组(给予Tau 40 mmol·L^(-1))、Tau 4组(给予Tau 80 mmol·L^(-1))、Tau 5组(给予Tau160mmol·L^(-1));阳性对照组DDP 4mg·L^(-1),作用时间分别为24、48、72h。应用MTT比色法检测人肺癌细胞株A549的细胞增殖,流式细胞术检测人肺癌细胞株A549的细胞凋亡率,分光光度法检测Caspase-9、Caspase-3的活性,免疫印迹法检测p53正向细胞凋亡调控因子(PUMA)的水平及Bax蛋白、Bcl-2蛋白的表达水平。结果Tau能够以时间剂量依赖方式来抑制A549细胞增殖,并显著增加A549细胞凋亡率。Tau可以明显增加A549细胞内Caspase-9、Caspase-3的活性,以及诱导A549细胞内PUMA、Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调。Tau对人胚肾细胞293T的细胞活性无明显影响。结论 Tau对人肺癌细胞株A549有增殖抑制和凋亡诱导的作用,其机制可能是Tau通过上调PUMA、Bax表达及下调Bcl-2表达,进而增加Caspase-9、Caspase-3的活性来诱导A549细胞发生凋亡。

PUMA对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

目的研究外源性p53正向细胞凋亡调控因子(p53up-regulated modulator of apoptosis protein,PUMA)基因对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法制备PUMA基因并插入pcDNA 3.1(-)质粒,观察其转染胃癌SGC-7901细胞后PUMA蛋白的表达并用MTT法检测细胞的增殖力[实验设3组,分别为无转染空白胃癌细胞对照(SGC-7901)组,空载质粒转染胃癌细胞对照(SGC-7901-pcDNA3.1)组及重组PUMA质粒实验(SGC-7901-pcDNA3.1-PUMA)组]。结果 PUMA经限制性核酸内切酶切及测序分析,与预期结果吻合。转染质粒后,SGC-7901组与SGC-7901-pcDNA3.1组PUMA表达比较差异无统计学意义(P>0.05,相对表达量分别为0.24±0.01和0.23±0.01),SGC-7901-pcDNA3.1-PUMA组与另2组比较PUMA表达明显增高(P<0.05,相对表达量为0.39±0.01)。SGC-7901、SGC-7901-pcDNA3.1和SGC-7901-pcDNA3.1-PUMA组的A值分别为0.43±0.04、0.46±0.04和0.32±0.03,SGC-7901-pcDNA3.1-PUMA组与另2组比较明显下降(均P<0.01),SGC-7901组与SGC-7901-pcDNA3.1组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论外源性人类PUMA基因对胃癌细胞增殖有抑制作用。

p53正向细胞凋亡调控因子基因表达改变对关节软骨细胞凋亡的影响

目的 观察p53正向细胞凋亡调控因子基因（PUMA）的表达对关节软骨细胞凋亡的影响.方法 通过白细胞介素（IL）-1β干预建立小鼠骨关节炎模型,再采用小分子RNA干扰片段对小鼠软骨细胞中的PUMA进行抑制,转染前后分别检测PUMA蛋白的表达及细胞凋亡.结果 空转染对照组PUMA蛋白表达量为空白对照组的6.11倍,空转染对照组分别为两个实验组的2.02倍和3.30倍.染色显示细胞凋亡率在空白对照组为3.6％,空转染对照组29.6％,两个实验组分别为9.0％和13.2％,实验组和空转染对照组的差异有统计学意义（P＜0.01）,抑制PUMA表达后细胞凋亡明显减少.结论 骨关节炎小鼠软骨细胞中PUMA基因表达增加,提示PUMA基因参与了骨关节炎软骨细胞凋亡.

PUMA在吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡过程中的作用

目的研究吉西他滨体外对人胰腺癌AsPC-1细胞生长的作用机制。方法用脂质体转染法将p53正向凋亡调控因子(PUMA)反义核酸(反义PUMA cDNA)的真核表达载体pcDNA3.1-PUMAAS和空载体pcDNA3.1-导入AsPC-1细胞,G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆。将转染载体的AsPC-1阳性克隆细胞和未转染载体的AsPC-1细胞分别暴露于浓度1、5、10和15μmol/ml的吉西他滨中作用72 h。RT-PCR和Western blotting检测不同组细胞经吉西他滨作用72 h后的PUMA表达;MTT检测细胞生长抑制,流式细胞仪(FCM)、Hoechst 33258荧光染色法和TUNEL法检测细胞凋亡。结果吉西他滨促进AsPC-1细胞凋亡,抑制细胞生长,并有明显的剂量依赖性,在细胞凋亡的同时伴有PUMA表达的上调;当细胞转染PUMA反义核酸抑制PUMA表达后,受吉西他滨作用的细胞出现PUMA蛋白表达明显降低,同时伴有细胞凋亡的抑制及细胞的明显增殖。结论吉西他滨促进体外AsPC-1细胞凋亡,并抑制其生长,其诱导凋亡与上调PUMA有关。

PUMA/ASPP_1双抑癌基因对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

目的探讨p53正向细胞凋亡调控因子(p53up-regulated modulator of apoptosis protein,PUMA)/p53促凋亡蛋白(apoptosis stimulating protein of p53,ASPP)1融合基因及单个基因对胃癌SGC-7901细胞的杀伤作用。方法通过脂质体(lipofectamine)2000TM将PUMA/ASPP1融合基因及PUMA、ASPP1单个基因分别转染胃癌SGC-7901细胞系[实验设5组,分别为胃癌细胞无转染空白对照(SGC-7901)组,空载质粒转染细胞对照(SGC-7901-pcDNA3.1)组以及重组ASPP1质粒转染细胞实验(SGC-7901-ASPP1)组、重组PUMA质粒转染细胞实验(SGC-7901-PUMA)组、重组PUMA/ASPP1质粒转染细胞实验(SGC-7901-PUMA/ASPP1)组],再次经G418筛选,获得稳定表达融合基因SGC-7901-PUMA/ASPP1细胞株。通过MTT法及使用流式细胞仪测定各组胃癌SGC-7901系细胞的存活数(光吸收度即A值)及细胞周期。结果 SGC-7901组与SGC-7901-pcDNA3.1组A值比较差异无统计学意义(P>0.05);SGC-7901-ASPP1组、SGC-7901-PUMA组和SGC-7901-PUMA/ASPP1组A值明显低于SGC-7901组与SGC-7901-pcDNA3.1组(均P<0.01);SGC-7901-ASPP1组、SGC-7901-PUMA组和SGC-7901-PUMA/ASPP13组中,SGC-7901-PUMA/ASPP1细胞组A值最低(P<0.01)。与SGC-7901组、SGC-7901-pcDNA3.1组比较,SGC-7901-ASPP1、SGC-7901-PUMA、SGC-7901-PUMA/ASPP1组的G1期明显增多,S期明显减少,尤以SGC-7901-PUMA/ASPP1组S期减少为甚(均P<0.01);SGC-7901-pcDNA3.1组与SGC-7901组比较G1期、S期差异无统计学意义(P>0.05)。结论双抑癌基因可有效抑制胃癌SGC-7901系细胞增殖,双抑癌基因较单个抑癌基因具有更强的抗肿瘤作用。

P53正向细胞凋亡调控因子抑制剂对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

P53正向细胞凋亡调控因子(P53 upregulated modulator of apoptosis,PUMA)是Bcl-2家族唯BH3结构域亚家族成员,位于线粒体内,可被多种损伤因素诱导激活。PUMA通过BH3结构域与Bcl-2样抗凋亡蛋白结合后发挥其促凋亡作用。PUMA抑制剂模拟蛋白间的结合作用,阻碍PUMA与Bcl-2样蛋白结合,凋亡被抑制。在体内,依小鼠肝脏缺血、再灌注时间不同,损伤情况各异。损伤较轻时,PUMA表达升高,PUMA抑制剂能够保护肝脏抵抗损伤;当损伤较严重时,PUMA表达升高不明显,PUMA抑制剂的保护作用也不明显。综合上述,在一定程度损伤的条件下,PUMA抑制剂可以有效地保护肝脏,减轻损伤。

PUMA与Caspase-3在乳腺癌组织中的表达及临床意义

目的:探讨乳腺癌组织中p53正向细胞凋亡调控因子(PUMA)和Caspase-3的表达及临床意义。方法:采用免疫组织化学方法检测65例浸润性乳腺癌、25例乳腺纤维腺瘤及20例乳腺癌旁组织中PUMA和Caspase-3的表达情况。结果:PUMA在浸润性乳腺癌组织中的表达明显低于乳腺纤维腺瘤组织(15.4%vs 36.0%,P<0.05),乳腺纤维腺瘤组织中的表达明显低于乳腺癌旁组织(36.0%vs70.0%,P<0.05)。PUMA的表达与肿瘤淋巴结转移、TNM分期、术后复发、雌激素受体(ER)及人类表皮生长因子受体-2(HER-2)密切相关(P<0.05)。Caspase-3在乳腺癌组织中的表达明显低于乳腺纤维腺瘤组织(21.5%vs 44.0%,P<0.05),乳腺纤维腺瘤组织中的表达明显低于乳腺癌旁组织(44.0%vs80.0%,P<0.05)。Caspase-3的表达与淋巴结转移、术后复发、ER、HER-2及肿瘤分化程度密切相关(P<0.05)。PUMA与Caspase-3在浸润性乳腺癌组织中的表达呈正相关(r=0.491,P<0.05)。结论:PUMA和Caspase-3在浸润性乳腺癌的发生、发展中起着重要作用,可能成为乳腺癌的分子标志物或治疗的新靶点。

microRNA-PUMA信号通路在非肿瘤性疾病中的研究进展

p53正向细胞凋亡调控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis, PUMA)在许多疾病的发生发展中发挥着至关重要的作用,其调控机制主要为转录水平的调控(p53依赖/非依赖途径)及翻译后磷酸化调控机制,相关microRNA-PUMA信号通路的发现,不仅为肿瘤性疾病的治疗提供了新依据,也为许多非肿瘤性疾病的治疗提供了新思路,如老年性急性心肌梗死、心脏瓣膜病、神经元退行性变、血脑屏障等疾病近年来有了新的突破,甚至有望成为疾病新的预测分子。本文主要从microRNA-PUMA相关通路的发现就近年来在非肿瘤性疾病中的研究作一综述。

Extracorporeal regulation effect of cytokines combination on stem cell or progenitor of umbilical blood

AIM:To study the regulation effect of different cytokines combinations on stem cell or progenitor of umbilical blood when no blood serum and matrix exist. METHODS: Collect and analyze the 23 sample of umbilical blood. RESULTS:(1) The combination of SCF+Flk2/Flt3 ligand and(FL)±TPO can amplify CD34,+,CD34+Thy 1+,CD34+CD33+and LTC IC in umbilical blood effectively and rapidly.(2) After add solubility type (sIL 6R)of IL 6 and IL 6 receptor into this combination, the stem cell or progenitor proliferated prominently;When add IL 6 alone(without sIL 6R), the content of CD34+cells and LTC IC didn’t increased obviously in early stage, but the amplification of CFU Mix and BFU E was not prominent as CFU GM. (3)Detect apoptosis rate of cells by FITC Annexin Ⅴlabeled by membranous change in early stage of cellular apoptosis. After add Flt3L and /or IL 6+sIL 6R, the Annexin Ⅴpositive cells decreased from 15.2%～19.1%to 2.8%～3.5%. CONCLUSION: In suspending system composed with SCF+TPO+Flt3L+IL 6+sIL 6R without matrix and blood serum, the umbilical blood can not only produce large amount of committed progenitor but also keep certain quantitive hematopoietic cells of early stage.

参芪扶正注射液对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究参芪扶正注射液对基底细胞样(basal-like型)乳腺癌MDA-MB^(-2)31细胞增殖和凋亡的影响,探讨参芪扶正注射液对三阴性乳腺癌的治疗作用机制。方法:体外培养人乳腺癌MDA-MB^(-2)31细胞,将其分为参芪扶正注射液组和空白组。采用噻唑蓝(MTT)比色法分别于24,48,72 h检测参芪扶正注射液对人乳腺癌MDA-MB^(-2)31细胞增殖的影响。采用流式细胞术(FCM)测定细胞周期分布和凋亡情况。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和免疫印迹(Western blot)检测参芪扶正注射液对MDA-MB^(-2)31细胞p53正向细胞凋亡调控因子(PUMA)表达的影响。结果:参芪扶正注射液可抑制MDA-MB^(-2)31细胞增殖,高浓度者抑制作用强,即呈现浓度依赖性,体外培养48 h时抑制作用最显著。参芪扶正注射液将MDA-MB^(-2)31细胞阻滞于细胞周期的S期,进而诱导MDA-MB^(-2)31细胞凋亡。Real-time PCR和Western blot发现参芪扶正注射液可上调MDA-MB^(-2)31细胞PUMA蛋白和基因表达。结论:参芪扶正注射液可显著抑制人乳腺癌MDA-MB^(-2)31细胞增殖,导致细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,其机制可能与上调PUMA基因有关。

PUMA基因在肝癌组织的表达及意义

目的研究p53正向细胞凋亡调控因子(PUMA)基因mRNA及其功能蛋白在肝癌组织中的表达及其临床意义。方法用半定量RT-PCR和Western blot方法检测42例肝癌患者的癌组织及其癌旁组织和42肝良性病变组织的PUMA mRNA及其编码蛋白表达。结果癌组织、癌旁组织和肝良性病变PUMA mRNA的表达量分别为0.81±0.07、0.97±0.04和1.76±0.06,PUMA蛋白的表达量分别为0.48±0.19、0.61±0.12和1.11±0.34;肝癌组织及癌旁组织的PUMAmRNA及其蛋白表达量明显低于肝良性病变组织高于(P<0.05)。结论 PUMA基因在肝癌组织中的表达下调,与癌的发生呈负相关。