p53正向凋亡调节因子重组腺病毒载体的构建及对胰腺癌细胞增殖的抑制作用

目的构建p53正向凋亡调节因子重组腺病毒（Ad-PUMA）载体，探讨Ad—PUMA对人体内外胰腺癌的治疗作用。方法利用Ad—Easy系统在大肠杆菌同源重组，构建Ad—PUMA腺病毒载体，在293细胞内成功包装并鉴定后，以Ad-PUMA转染人转移胰腺癌细胞株AsPC-1。用MTT法检测转染前后存活细胞，观察Ad．PUMA的体外抑瘤作用；用Western blot方法鉴定转染前后AsPC-1细胞内PUMA蛋白表达。通过裸鼠皮下胰腺癌移植瘤模型观察Ad-PUMA的体内抑瘤效果；Western blot方法鉴定Ad—PUMA转染后肿瘤组织内PUMA蛋白表达，TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase biotin—dUTP nick end labeling）法检测肿瘤组织细胞凋亡。结果在体外，随着Ad—PUMA感染剂量增加，细胞内PUMA蛋白表达逐渐增加，细胞存活率逐渐下降；在体内，Ad—PUMA可显著抑制裸鼠皮下肿瘤的生长，其抑瘤率为44．2％，瘤体组织PUMA表达水平及凋亡指数明显升高。结论PUMA抑制体内外胰腺癌细胞增殖，可能是-种潜在的肿瘤生物治疗手段。

具有捕食正效应的捕食-食饵系统

在经典的捕食食饵系统中考虑到由于捕食效应对食饵种群带来的正向调节作用后,提出了具有捕食正效应的捕食-食饵系统。通过对模型的动力学行为的分析,从理论上说明了正向调节作用对系统的影响,并就第一象限内平衡点存在时的相图解释了捕食正效应的作用。结果表明:(1)捕食系统中适当的正向调节作用会增加系统的稳定性;(2)当捕食正效应达到一定的程度后系统拥有一个不稳定的极限环;(3)当捕食正效应过大时会使系统的稳定性发生变化,使捕食者种群与食饵种群同时趋向无穷,出现了调节放纵现象。这些结果在保护生物学中具有重要的意义。

川芎嗪对人结肠癌LoVo细胞增殖与凋亡的影响

目的研究川芎嗪对人结肠癌LoVo细胞增殖与凋亡的影响及作用机制。方法采用质量浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL川芎嗪分别作用LoVo细胞24 h、48 h和72 h,MTT比色法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR和Western blot分别检测细胞基因p53正向凋亡调节因子(PUMA)及Bax、Bcl-2的mRNA和蛋白表达。结果川芎嗪可有效抑制人结肠癌LoVo细胞的增殖,并诱导凋亡,且显示质量浓度时间依赖性(P<0.01);但川芎嗪对293T细胞的生长无显著性影响。质量浓度为1.0、2.0、4.0 mg/mL川芎嗪均能提高PUMA mRNA和蛋白表达,进而促进Bax mRNA和蛋白表达上调,同时下调抗凋亡基因Bcl-2 mRNA和蛋白表达(P<0.01)。结论PUMA及其下游信号通路介导了川芎嗪抑制人结肠癌LoVo细胞增殖及促凋亡作用。

PUMA基因对胰腺癌细胞BxPC-3的促凋亡作用及其可能机制

目的:研究P53正向凋亡调节因子基因(P53 up-regulate modulator of apoptosis,PUMA)对胰腺癌细胞株BxPC-3凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:以100 MOI的携PUMA基因重组腺病毒(Ad-PUMA)感染BxPC-3细胞0～96 h,流式细胞术检测BxPC-3细胞凋亡率,Western blotting检测BxPC-3细胞中PUMA、Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3蛋白的表达,Western blotting检测BxPC-3细胞中细胞质和线粒体内Bax的表达及Bax寡聚体。结果:随着Ad-PUMA感染时间的延长,BxPC-3细胞凋亡率逐渐增加,48 h时最高。Ad-PUMA感染促进BxPC-3细胞中PUMA、Cytochrome C和Caspase-3蛋白的表达,抑制BxPC-3细胞中Bcl-2蛋白的表达。Ad-PUMA感染后BxPC-3细胞的凋亡率与BxPC-3细胞中PUMA蛋白的表达具有明显的相关性。Ad-PUMA感染不影响BxPC-3细胞中Bax蛋白的总表达量,但细胞质中的Bax几乎完全消失,而线粒体中的Bax表达明显增加;Ad-PUMA感染诱导BxPC-3细胞中Bax蛋白的寡聚化。结论:PUMA基因通过线粒体途径促进胰腺癌细胞凋亡。

MTHFD2对人肝癌细胞凋亡的影响及其作用机制研究

目的探讨亚甲基四氢叶酸脱氢酶2(MTHFD2)对人肝细胞癌(HCC)细胞凋亡的影响及其作用机制。方法将对数生长期的HepG2和SMMC-7721细胞随机分为siMTHFD2#1组、siMTHFD2#2组和siCtrl组3组,分别转染MTHFD2-siRNA#1、MTHFD2-siRNA#2及Ctrl-siRNA。通过siRNA技术构建MTHFD2和p53正向凋亡调节因子(Puma)敲低的HCC细胞模型,分为siMTHFD2+siPuma组(共转染MTHFD2-siRNA和Puma-siRNA)、siMTHFD2组(转染MTHFD2-siRNA)、siPuma组(转染Puma-siRNA)、siNC组(转染阴性对照剂Ctrl-siRNA)。采用流式细胞术和Western blot法检测敲低MTHFD2表达后细胞凋亡率和凋亡相关信号通路的蛋白表达水平变化情况。通过CCK-8实验和流式细胞术进一步分析MTHFD2和Puma共敲减后细胞增殖能力和凋亡率的变化情况。结果HepG2和SMMC-7721细胞中siMTHFD2#1组和siMTHFD2#2组的MTHFD2表达水平均明显低于siCtrl组(均P<0.01)。HepG2和SMMC-7721细胞中siMTHFD2#1组和siMTHFD2#2组的细胞凋亡率均明显高于siCtrl组(均P<0.01)。与siCtrl组比较,siMTHFD2#1组和siMTHFD2#2组HepG2和SMMC-7721细胞的Cleaved Caspase3/Pro Caspase3、Cleaved Caspase7/Pro Caspase7比值均明显升高,siMTHFD2#1组和siMTHFD2#2组SMMC-7721细胞的Cleaved PARP/Pro PARP比值明显升高(均P<0.05)。与siCtrl组比较,SMMC-7721细胞siMTHFD2#1组和siMTHFD2#2组中Puma表达水平均明显升高(均P<0.01),3组Bim、Bid、Bad、Bik、Bak、Bax表达水平比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。在96 h的时间点,siMTHFD2组OD值低于siNC组,而siMTHFD2+siPuma组的OD值则明显高于siMTHFD2组(均P<0.01)。siMTHFD2组凋亡率高于siNC组,siMTHFD2+siPuma组则明显低于siMTHFD2组(均P<0.01)。结论抑制MTHFD2的表达能够诱导人HCC细胞发生凋亡,是通过上调Puma表达水平来实现的。

NF-κB和PUMA与重症胰腺炎致急性肺损伤的关系以及PDTC的干预作用

目的 探讨NF-κB（核因子-κB）与PUMA（P53正向凋亡调节因子）表达在大鼠重症急性胰腺炎致急性肺损伤（SAP-ALI）的作用及脯氨酸二硫代氨基甲酸酯（PDTC）的影响.方法 SD大鼠随机（随机数字法）分为假手术组、SAP-ALI组、PDTC组,每组18只.各组再按6,12,24 h时间点分为三个亚组,每个亚组6只.假手术组开腹后翻动胰腺数次;SAP-ALI组采用胰胆管逆行注入5%牛磺胆酸钠（1 mL/kg）诱导SAP-ALI模型;PDTC组在SAP-ALI组的基础于术前1h给予PDTC（15 mg/kg）,各组按时间点处死大鼠.观察胰腺和肺脏病理变化.Western-blot法检测肺组织NF-κB p65,PUMA表达,采用RT-PCR法测量各组bax,bcl-2和Caspase-3 mRNA,通过荧光检测试剂检测Caspase-3活性.投射电镜下观察各组肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构的变化,TUNEL检测肺泡上皮细胞的凋亡指数.结果 成功建立了大鼠SAP-ALI模型,Western-blotting结果显示,SAP-ALI组肺组织NF-κB p65和PUMA蛋白表达在6h后增加,24 h增加最明显,NF-κB p65与PUMA显著正相关;SAP-ALI组肺组织bax mRNA和Caspase-3mRNA在6 h后增加,24 h增加最明显,bcl-2 mRNA在6 h后下降,24 h下降最明显,Caspase-3活性在24h增加最明显.PDTC组肺组织NF-κB p65和PUMA蛋白表达明显降低;bax mRNA和caspase-3 mRNA表达及Caspase-3活性明显降低,bcl-2 mRNA表达明显增加.假手术组肺组织各组蛋白的表达与PDTC组比无显著改变.PDTC组肺损伤病理组织学评分在术后各时间点较SAP-ALI组显著降低,PDTC组细胞凋亡指数较SAP-ALI组明显降低.SAP-ALI组24h市泡Ⅱ型上皮细胞微绒毛消失.结论 NF-κB活化激活PUMA与肺泡上皮细胞凋亡有关,PDTC通过抑制NF-κB活化,下调NF-κB活化后引起的PUMA表达,抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡,减轻SAP-ALI.

肺组织NF-κB和PUMA与SAP-ALI的关系及PDTC的干扰作用

目的探讨NF-κB(核因子-κB)和PUMA(p53正向凋亡调节因子)在大鼠重症急性胰腺炎致急性肺损伤(SAP-ALI)发病中的作用及脯氨酸二硫代氨基甲酸酯(PDTC)对此过程的影响。方法 SD大鼠随机分为假手术组(A组),SAP-ALI组(B组),SAP+PDTC干预组(C组),每组24只。各组再按6,12,24 h时点分为3个亚组,每亚组8只。A组开腹后翻动胰腺数次;B组采用胰胆管逆行注入5%牛磺胆酸钠(1 mL/kg)诱导SAP-ALI模型;C组在B组的基础上于术前1 h给予PDTC(15 mg/kg),各组按各时点处死大鼠。观察胰腺和肺脏病理变化。检测不同组肺脏组织中NF-κBp65,PUMA和Caspase-3的表达及Caspase-3活性;检测组织TNF-α,MIP-2和ICAM-1 mRNA的表达、髓过氧化物酶(MPO)的活性和肺泡上皮细胞凋亡指数。结果成功建立大鼠SAP-ALI模型。Western-blotting和RT-PCR结果显示,B组肺上皮细胞NF-κB p65,PUMA和Caspase-3蛋白表达在12 h后显著增加(P<0.05),NF-κB p65与PUMA呈高度正相关(r=0.987,P<0.01)。TNF-α,MIP-2,ICAM-1mRNA表达及MPO和Caspase-3活性明显增加(P<0.01)。C组肺损伤病理组织学评分在术后各时点较B组显著下降(P<0.05),C组12 h后的肺组织NF-κB p65,PUMA和Caspase-3蛋白表达及MPO和Caspase-3活性明显降低(P<0.05);TNF-α,MIP-2,ICAM-1 mRNA表达明显下降(P<0.05),C组细胞凋亡指数较B组明显降低(P<0.01)。结论大鼠SAP-ALI既与NF-κB活化引起的炎症因子释放有关又与NF-κB活化引起的PUMA上调促进细胞凋亡有关。PDTC通过抑制NF-κB活化,下调炎症因子释放及NF-κB活化引起的PUMA表达可抑制肺组织的细胞凋亡,从而减轻SAP-ALI的程度。

PUMA在相关肿瘤性疾病中的表达的研究进展

p53正向细胞凋亡调控因子(p53up-regulated modulator of apoptosis,PUMA)在许多肿瘤的发生发展中发挥中至关重要的作用,其调控机制主要为转录水平的调控(P53依赖/非依赖途径)及翻译后磷酸化调控机制,相关Puma的调节因子和信号通路的发现,为治疗肿瘤的相关抗癌药物提供了新依据。本文主要从Puma与相关肿瘤性疾病中发挥的作用就近年来的研究作一综述,旨在为肿瘤的治疗及预后提供思路。