Twist基因逆转录病毒载体的构建及其诱导正常乳腺上皮细胞发生上皮间质转化

目的构建Twist基因逆转录病毒载体,研究其对人正常乳腺上皮细胞MCF10A的影响。方法酶切pcDNA3/mycTwist获得myc-Twist,克隆到逆转录病毒载体pBABE-puro中,构建重组质粒pBABE-myc-Twist。通过酶切、测序鉴定Twist基因正确后,在体外将质粒pBABE-myc-Twist和其对照分别与包装质粒pAmpho共同转染人胚肾上皮细胞系293T细胞,进行逆转录病毒的包装,并感染人正常乳腺MCF10A上皮细胞,用嘌呤霉素(puromycin)筛选,获得成功转入Twist的MCF10A-Twist细胞和MCF10A-Vector对照细胞。通过RT-PCR和Western blot法验证Twist细胞在MCF10A-Twist和MCF10A-Vector细胞内的表达。免疫荧光技术和Western blot法检测细胞内上皮间质转化(EMT)标志蛋白的表达。Transwell^(?)法检测细胞的迁移和侵袭能力。结果重组逆转录病毒载体质粒pBABE-myc-Twist经酶切和测序鉴定构建正确;Twist基因被逆转录病毒成功导入MCF10A细胞,并在靶细胞内稳定表达,RT-PCR检测到Twist mRNA在MCF10A-Twist细胞中表达,Western blot法检测发现myc-Twist蛋白在MCF10A-Twist细胞中表达;免疫荧光和Western blot法检测显示在MCF10A-Twist细胞中E-cadherin表达显著下调、vimentin表达明显上调;与MCF10A-Vector细胞相比,Transwell^(?)法检测发现MCF10A-Twist细胞迁移和侵袭能力明显增加(P<0.01)。结论 Twist诱导MCF10A细胞发生EMT转化,并促进其迁移和侵袭。

TCERG1L在乳腺癌中的表达及其与ERα的相互调控

目的探讨转录伸长调节因子1-like(Transcription elongation regulator 1-like,TCERG1L)在正常乳腺上皮细胞、导管原位癌细胞和浸润性导管癌(乳腺非特殊型浸润性癌)细胞中表达的异同,并探究其与ERα(Estrogen Receptorα)基因的相互调控。方法免疫组化评估61例乳腺导管原位癌(Ductal Carcinoma In Suit,DCIS)、60例乳腺浸润性导管癌(Invasive Ductal Carcinoma,IDC)和60例良性乳腺病变组织中TCERG1L及ERα的表达情况。Western blot检测TCERG1L和ERα在正常乳腺上皮细胞株HBL-10和乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231中的表达并分析二者的相互调控关系。结果与正常乳腺上皮细胞对比,乳腺导管原位癌和浸润性导管癌细胞中TCERG1L的表达显著降低,组织切片及细胞株检测均显示TCERG1L与ERα相互抑制彼此的表达。结论TCERG1L表达显著降低是ERα阳性的乳腺浸润性导管癌的特征。TCERG1L有助于ERα阳性乳腺癌的鉴别诊断。