胃癌组织中胃癌相关成纤维细胞、胃正常成纤维细胞的分离鉴定及增殖情况观察

目的从胃癌组织中分离胃癌相关成纤维细胞(CAFs)及胃正常成纤维细胞(NFs),并鉴定其功能。方法3例胃癌患者,均行胃癌切除术,术中保留胃癌组织及胃正常黏膜组织。采用组织贴壁块法及胶原酶消化法分离胃癌组织中的胃CAFs及胃正常黏膜组织中的胃NFs。原代培养胃CAFs、胃NFs,差速贴壁传代法分离并纯化细胞,差速贴壁20 min。倒置显微镜下观察胃CAFs、胃NFs细胞形态,采用免疫细胞化学染色法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、角蛋白18(CK18)、波形蛋白(Vimentin)。取3个来源分离的胃CAFs、胃NFs,分别于细胞贴壁24 h、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d采用MTT法测算细胞光密度(OD)值,绘制细胞生长曲线。结果胃癌CAFs细胞大小不一,呈梭形或星形,排列不规则并呈重叠生长;胃NFs细胞均匀一致,呈长梭形,排列规则。胃CAFs细胞存在α-SMA、Vimentin阳性表达,CK18阴性表达,胃NFs细胞存在Vimentin阳性表达,α-SMA、CK18阴性表达。培养3~6天,各来源胃CAFs细胞OD值均高于胃NFs(P均<0.05)。结论成功分离胃CAFs、胃NFs。胃CAFs、胃NFs均存在Vimentin表达。胃CAFs增殖能力优于胃NFs。

骨膜蛋白在眼睑基底细胞癌相关成纤维细胞与眼睑正常成纤维细胞中的表达差异

目的比较对已分离、培养、纯化、鉴定的眼睑基底细胞癌相关成纤维细胞(basal cell carcinoma associated fibroblasts,BCAFs)与眼睑正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)中骨膜蛋白(periostein,PN)表达差异。方法取生长良好的第3代纯化的BCAFs和NFs,用胰蛋白酶调制细胞悬液的浓度均为20×103个·m L^(-1),按每孔2 m L细胞悬液接种六孔板。以无血清培养基培养48 h后收集上清液,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BCAFs与NFs上清液中PN的含量;以盖玻片置于六孔板底制作细胞爬片,应用免疫荧光细胞化学染色技术检测BCAFs与NFs中PN的表达。结果眼睑BCAFs与NFs上清液中PN的含量分别为(9.26±2.35)μg·L^(-1)和(2.57±0.41)μg·L^(-1);细胞免疫荧光化学染色检测PN表达显示,眼睑BCAFs中强于NFs,差异有统计学意义(P<0.05)。结论眼睑BCAFs较NFs高表达分泌PN,提示PN在眼睑基底细胞癌的局部侵袭生长中起着一定作用。

IL-13对正常人表皮成纤维细胞产生炎症因子作用的实验研究

目的探讨白介素-13(IL-13)对正常人表皮成纤维细胞(NHDF)产生炎症因子的影响。方法使用不同浓度IL-13(0.1、1、10ng/ml)刺激体外培养的NHDF,应用ELISA方法检测IL-13刺激NHDF24h后,白介素-6(IL-6),白介素-8(IL-8),巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)的蛋白表达水平。结果0.1ng/mlIL-13刺激下,IL-6、MCP-1和Eotaxin的蛋白表达水平分别为(727.33±39.88)pg/ml、(414.67±13.01)pg/ml、(124.67±8.67)pg/ml;1ng/mlIL-13刺激下,分别为(1222.50±49.95)pg/ml、(705.33±25.15)pg/ml、(205.33±16.59)pg/ml;10ng/mlIL-13刺激下,分别为(1502.83±5.31)pg/ml、(1329.17±56.08)pg/ml、(457.50±15.32)pg/ml,均明显高于对照组[(283.50±15.86)pg/ml、(205.17±3.76)pg/ml、(13.50±5.01)pg/ml,P<0.05或0.01],并具有浓度依赖性。IL-8蛋白表达水平与对照组无显著性差异(P>0.05)。结论IL-13可刺激NHDF产生IL-6、MCP-1和Eotaxin,这些炎症因子的大量表达可能参与了IL-13在皮肤组织纤维化过程中的病理性作用。

IL-13对正常人表皮成纤维细胞炎症及纤维化相关基因表达的影响

目的探讨IL-13对正常人表皮成纤维细胞(NHDF)炎症及纤维化相关基因的作用,从而进一步了解IL-13在皮肤纤维化过程中的病理机制。方法将不同浓度的IL-13(0.1ng/mL,1ng/mL,10ng/mL)加入到体外培养的NHDF,作用24h后,采用实时定量PCR(Real-TimePCR)方法 ,研究不同浓度IL-13刺激NHDF后CCL-2,IL-13ra1,IL-13ra2,CTGF和Pro-collagenI基因的表达情况。结果不同浓度的IL-13刺激NHDF24h后,CCL-2,IL-13ra2和Pro-collagenI基因表达显著增加(P<0.05),并呈剂量依赖关系;IL-13ra1和CTGF基因表达无明显改变(P>0.05)。结论 CCL-2,IL-13ra2和Pro-collagenI基因的高表达可能参与了IL-13在皮肤组织纤维化中的病理过程。

口腔癌相关成纤维细胞对人淋巴管内皮细胞增殖、迁移、侵袭、成管的影响

目的研究口腔癌相关成纤维细胞(CAFs)在口腔鳞状细胞癌淋巴管生成过程中的作用。方法通过组织块法分离、培养口腔鳞状细胞癌患者的CAFs和正常成纤维细胞(NFs),免疫组织化学染色鉴定CAFs和NFs。利用24孔的transwell细胞培养室分别将CAFs(实验A组)、NFs(实验B组)与人淋巴管内皮细胞(HLEC)共培养,以DMEM高糖培养基作为空白对照组,在倒置相差显微镜下观察各组HLEC的增殖、迁移、侵袭、成管能力。结果培养96、144、192 h,实验A组HLEC的数目均多于实验B组和空白对照组,实验B组多于空白对照组(P<0.01)。培养96 h后,实验A组HLEC的迁移和侵袭数目均多于实验B组和空白对照组,实验B组多于空白对照组(P<0.01)。培养24 h后,实验A组HLEC的成管数目多于实验B组和空白对照组,实验B组多于空白对照组(P<0.01)。结论口腔CAFs促进了HLEC的增殖、迁移、侵袭和成管作用,并且CAFs的促进作用大于NFs。

CRs、MMPs、VEGF在胰腺癌肿瘤相关成纤维细胞中的表达及其意义

目的探讨趋化因子受体(chemokine receptors,CRs)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达与胰腺癌肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)生物学行为的关系。方法用原代培养的方法建立胰腺癌CAFs和正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)。用Real-time PCR方法检测CRs(CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7)、MMPs(MMP1、MMP2、MMP7、MMP9)和VEGF m RNA的表达。结果成功建立胰腺癌CAFs和正常胰腺NFs。在CAFs和NFs中,趋化因子受体CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7 m RNA的表达均存在差异,CAFs表达量高于NFs。其中CXCR2、CXCR4 m RNA在两株细胞中的表达差异具有统计学意义(P=0.010,P=0.049)。MMPs和VEGF m RNA的表达同样存在差异,CAFs中MMP7和VEGF m RNA表达明显高于NFs,差异具有统计学意义(P=0.017,P=0.049);CAFs中MMP9 m RNA的表达明显低于NFs,差异具有统计学意义(P=0.012)。结论在胰腺癌CAFs中CRs、MMPs和VEGF m RNA的表达有差异,可能与其促侵袭转移能力存在一定的相关性。

铁皮石斛对人正常皮肤成纤维细胞GM0639辐照后微核的影响研究

目的分析铁皮石斛煎剂作用后人正常皮肤成纤维细胞GM0639微核的变化。方法通过MTT法测定不同药物浓度及不同药物作用时间对GM0639细胞存活率的影响，MTT法测定相同剂量^60Coγ射线辐照后培养24h未加药组和加不同浓度药物组细胞的存活率，通过胞质分裂阻滞法（CB法）计数铁皮石斛煎剂作用联合不同剂量^60Coγ射线照射后的微核率（Micronucleus frequency，MNF）和微核细胞率（Micronucleus cell frequency，MNCF），将铁皮石斛煎剂作用的GM0639细胞与单纯照射细胞的微核率和微核细胞率的统计分析结果进行比较。结果铁皮石斛煎剂在给药浓度0-100mg／mL范围内，铁皮石斛对GM0639细胞没有细胞毒性。4Gy照射后培养24h，随着药物浓度的增加，细胞的存活率均显著增加，加药60mg／mL就可明显提高细胞的存活率。4Gy照射后培养24h，在试验药物浓度为60mg／mL，作用时间为24h时，将CB微核法得到的数据进行回归拟合可以得到药物作用及未经药物作用的剂量效应曲线，比较两组曲线，铁皮石斛作用组的微核率及微核细胞率明显低于单纯照射组（P〈0．05）。结论铁皮石斛可以降低辐照后GM063细胞微核率及微核细胞率，铁皮石斛具有较好的抗辐射作用。

肿瘤相关成纤维细胞的来源和分子机制(英文)

肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)不仅在细胞外基质的沉积,而且在肿瘤的生长、进展和转移中发挥重要作用。正常成纤维细胞、上皮细胞,内皮细胞和间质干细胞被认为是CAFs的主要来源。本文对CAFs的来源、分子机制和可能的潜在治疗靶作一综述。

成纤维活化蛋白在眼睑基底细胞癌相关成纤维细胞中的表达研究

目的:通过培养、分离、纯化、鉴定眼睑基底细胞癌相关成纤维细胞(CAFs)及正常眼睑皮肤成纤维细胞(NFs),将两种成纤维细胞的生物学特性和成纤维活化蛋白(FAP)表达情况进行对比研究,以进一步探究FAP以及CAFs在眼睑基底细胞癌发病及其发展中的作用及意义。方法:将眼睑基底细胞癌及眼睑正常皮肤组织块贴壁培养获得原代CAFs及NFs,于倒置相差显微镜下观察纯化的两种细胞第3代的细胞形态并用细胞免疫化学染色(SP法)鉴定两种细胞;MTT法检测细胞生长增殖活力;通过RT-qPCR、Western Blot分别检测其FAP mRNA、蛋白在两种细胞中的表达差异。结果:眼睑CAFs呈长梭形或纺锤形,胞质突明显减少,而胞浆内具有较多颗粒,细胞体积差异明显,排列紊乱且密集,丧失接触抑制,存在明显的重叠生长现象;NFs呈长梭形,但胞浆内颗粒少见,细胞体积较均一,放射状排列,存在接触抑制,未见重叠生长。眼睑CAFs的增殖速度明显快于NFs。RT-qPCR法检测眼睑CAFs中FAP mRNA相对于内参的表达量为3.672±0.221,明显高于眼睑NFs中的含量1.034±0.024(P<0.05)。Western Blot法检测两种细胞中FAP蛋白表达水平发现,FAP在眼睑CAFs中高表达,而眼睑NFs中几乎不表达(P<0.05)。结论:眼睑CAFs与眼睑NFs在形态结构、生长增殖、生长因子表达等生物学特征方面发生了显著改变,提示肿瘤微环境随眼睑基底细胞癌的发生发展相应地发生了一些变化,进而诱导NFs生物学特性和功能发生改变,最终转变为CAFs。此外,眼睑CAFs较NFs高表达分泌FAP,表明肿瘤细胞微环境中FAP可能参与肿瘤的发生发展,与眼睑基底细胞癌浸润性生长有一定关系。

阿魏酸哌嗪对TGF-β_1诱导肾成纤维细胞表型活化的影响

目的观察阿魏酸哌嗪对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导肾成纤维细胞表型活化的影响,探讨其抗肾间质纤维化的可能机制。方法体外培养正常大鼠肾脏成纤维细胞(NRK-49F),利用MTT观察阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞活力的影响;免疫细胞化学法观察阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达的影响;实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(realtime RT-PCR)检测阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞α-SMA及CTGFmRNA表达的作用,双抗体夹心ABC-ELISA法检测阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞上清型胶原(Col)、纤维连接蛋白(FN)表达的影响。结果TGF-β1可以显著增加大鼠肾脏成纤维细胞活力,上调细胞α-SMA、CTGF蛋白和mRNA的表达以及Col、FN的表达。与TGF-β1刺激组相比,阿魏酸哌嗪能部分抑制TGF-β1诱导的细胞活力增加、α-SMA、CTGF的表达和细胞外基质(ECM)的合成。结论阿魏酸哌嗪可以在一定程度上拮抗TGF-β1诱导的肾纤维化效应。

H_2O_2诱导对正常人皮肤成纤维细胞β-catenin、SMP30基因表达的影响

目的观察过氧化氢(H_2O_2)对正常人皮肤成纤维细胞(NHSF)β-链蛋白(β-catenin)和衰老标记蛋白30(SMP30)基因表达的影响,探讨H_2O_2可能诱导NHSF衰老的机制。方法将传至2~4代的NHSF细胞随机分为2组:对照组和实验组。对照组NHSF细胞未作任何处理。实验组将NHSF细胞培养24h后,分别给予50(实验1组)、100(实验2组)、150(实验3组)μmol·L-1的H_2O_2。在1、2、3h后,采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测各组β-catenin、SMP30基因表达的水平,并计算β-catenin mRNA、SMP30 mRNA值。结果与对照组比较,实验组β-catenin、SMP30基因表达水平和实验1、2、3组1、2、3h时β-catenin mRNA、SMP30mRNA水平均明显降低(均P<0.05);与实验2组比较,实验1组1、2、3h时β-catenin mRNA、SMP30 mRNA水平均明显升高,实验3组1、2、3h时β-catenin mRNA、SMP30 mRNA水平均明显降低(均P<0.05)。β-catenin、SMP30基因的表达对H_2O_2诱导有较为明显的时间依赖性和浓度剂量依赖性。结论 H_2O_2处理后NHSF细胞中β-catenin、SMP30基因表达水平明显降低,H_2O_2可能在诱导NHSF衰老中起重要作用。

神经生长因子p75受体与sortilin在皮肤及瘢痕成纤维细胞中的表达

背景:既往研究发现神经生长因子在创面愈合过程中发挥重要作用,但对于成纤维细胞中神经生长因子低亲和力受体p75及sortilin的研究较少,p75及sortilin在瘢痕组织成纤维细胞及正常皮肤组织成纤维细胞中的表达量是否有差异目前未见报道。目的:比较神经生长因子低亲和力受体p75及soritilin在瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞的中表达的差异。方法:体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞,并以人永生化上皮细胞HaCaT为阳性对照。通过实时定量PCR在mRNA水平检测p75及sortilin在瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞的表达及差异,进一步通过Western-blot及细胞免疫化学方法观察p75神经营养因子受体及sortilin在蛋白水平的表达及差异。结果与结论:实时定量PCR及Western blot结果可见,在mRNA及蛋白水平瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞中p75,sortilin均呈阳性表达,其中瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞中p75及sortilin在mRNA及蛋白水平表达量明显少于HaCaT,且p75在瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞中表达差异无显著性意义,sortilin表达量在瘢痕疙瘩成纤维细胞中明显低于正常皮肤成纤维细胞(P<0.05)。免疫细胞化学结果显示p75及sortilin在瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞中的表达部位均位于胞膜及胞浆。由于神经生长因子前体与p75受体高亲和力结合并在sortilin协助下发挥促进细胞凋亡的作用,sortilin在瘢痕成纤维细胞的表达明显低于正常皮肤成纤维细胞,可能与其高增殖状态有关,该结果为病理性瘢痕的防治提供了新的靶点。

单壁碳纳米管对瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响

目的探讨体外不同剂量单壁碳纳米管(SWCNTs)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(HKF)和正常皮肤成纤维细胞(HSF)增殖、凋亡相关基因表达和凋亡率的影响。方法设置7个剂量组(0.8、1.6、3.2、6.3、12.5、25.0、50.0μg/mL),将SWCNTs颗粒悬液分别加入HKF和HSF孵育。对照组经24h孵育后,利用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测SWCNTs对HKF和HSF细胞增殖的影响,利用流式细胞仪观察细胞凋亡并用Western Blot法测定P53、Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果不同浓度SWCNTs对HKF和HSF细胞增殖均具有抑制作用。与HKF对照组相比,HKF各加药组在3.2μg/mL WCNTs处理时P53蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达显著下降(P<0.01),Bax在1.6μg/mL SWCNTs处理时蛋白表达显著升高(P<0.01);与HSF对照组相比,HSF各加药组P53、Bax和Bcl-2在1.6μg/mL SWCNTs处理时蛋白表达显著升高(P<0.01);HKF对照组凋亡率为4.13%,3.2μg/mL的SWCNTs处理时凋亡率升高到12.16%,12.5μg/mL的SWCNTs处理时凋亡率为16.3%,凋亡率均较对照组显著升高(P<0.01);HSF对照组凋亡率为8.04%,3.2μg/mL SWCNTs处理时凋亡率升高到12.84%,12.5μg/mL SWCNTs处理时凋亡率为16.15%,凋亡率均较对照组显著升高(P<0.01)。结论一定剂量的SWCNTs颗粒悬液对体外培养的HKF和HSF均可产生抑制增殖和促进细胞凋亡的作用。

体内外不同环境下成纤维细胞丝裂素原激活蛋白激酶的变化

目的:观察脱离体内环境因素时成纤维细胞中信号蛋白表达及细胞生物学特性的变化。方法:瘢痕疙瘩和正常皮肤(作为阴性对照)均来自北京大学第三医院成形科手术患者各6例。取小块瘢痕疙瘩和正常皮肤组织,用组织块接种法进行成纤维细胞原代培养后,进行细胞传代。试验所用为第5～8代细胞。①评价信号蛋白的含量,用体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中p44/42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶的积分吸光度值。②评价信号蛋白的活化强度,用体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中p44/42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶的平均积分吸光度值。③评价信号蛋白的活化程度用活化率值(磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值÷p44/42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值)。结果:①p44/42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶平均积分吸光度值比较:瘢痕疙瘩成纤维细胞均低于正常皮肤成纤维细胞(0.023±0.005和0.025±0.005,0.030±0.000和0.042±0.004,P<0.05)。②p44/42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值比较:瘢痕疙瘩成纤维细胞p44/42丝裂原活化蛋白激酶高于正常皮肤成纤维细胞(6048.7±1576.2,3006.3±174.4,P<0.05),瘢痕疙瘩成纤维细胞磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶与正常皮肤成纤维细胞无差异(4876.0±895.8,3966.5±533.1,P>0.05)。③p44/42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶活化率比较:瘢痕疙瘩成纤维细胞低于正常皮肤成纤维细胞(0.830±0.134,1.319±0.156,P<0.05)。结论:成纤维细胞在脱离生物体内环境后,其生物学特性发生改变。体外细胞培养中,磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶的表达水平在瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞间无明显差别,而p44/42丝裂原活化蛋白激酶的活化程度和活化强度在正常皮肤成纤维细胞明显高于瘢痕疙瘩成纤维细胞。

5-Fu作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞后Caspase-3变化的研究

目的:从蛋白层面证明瘢痕疙瘩、正常皮肤成纤维细胞中Caspase-3蛋白表达水平存在差异。通过5-fu(5-氟尿嘧啶)浓度梯度作用瘢痕疙瘩成纤维细胞后,观察细胞中Caspase-3蛋白的表达,及细胞增殖、迁移和侵袭性变化。方法:临床手术获取瘢痕疙瘩、正常皮肤组织块,培养瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast KF)及正常皮肤成纤维细胞(normal skin fibroblast NSF),应用免疫组织化学及Western blot检测组织块及细胞中Caspase-3蛋白的表达;将5-fu(5-氟尿嘧啶)浓度梯度作用瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)后,应用Western blot检测Caspase-3蛋白的表达;CCK-8法检测KF细胞增殖情况;Trans-wells小室实验检测KF细胞的体外迁移和侵袭能力。结果:瘢痕疙瘩组织、正常皮肤组织、KF、NSF中均有Caspase-3蛋白的表达;KF中Caspase-3蛋白表达水平明显低于NSF,差异有统计学意义(P<0.05),瘢痕疙瘩组织块中Caspase-3蛋白表达水平明显低于正常皮肤组织,差异存在统计学意义(P<0.05);5-fu作用KF后,Western blot显示随着5-fu浓度的降低,KF中caspase-3蛋白表达减少,差异存在统计学意义(P<0.05)。CCK-8结果显示,随着5-fu浓度的降低,对KF增值活性的抑制不断减弱,差异有统计学意义(P<0.05);Trans-well侵袭结果显示侵袭到下室的KF数目随5-fu浓度的不断降低,而增多。结论:Caspase-3在KF中的表达明显低于NS,同时是5-fu诱导KF凋亡的关键因子,5-fu以浓度依赖方式促进Caspase-3活性增高,同时抑制KF增值、侵袭、迁移等肿瘤特性。

特发性肺纤维化病人肺成纤维细胞过度表达单核细胞趋化蛋白-1

目的研究凝血酶对正常人肺成纤维细胞(normalhuman lung fibroblasts,N-LF)和特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)病人肺成纤维细胞(F-LF)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响。方法 N-LF和F-LF细胞分别培养于96孔培养板内,凝血酶诱导4和24h后,收集上清液并用ELISA方法检测MCP-1蛋白水平。结果凝血酶可诱导N-LF和F-LF细胞释放MCP-1,但F-LF细胞的MCP-1分泌水平远远高于N-LF细胞。结论人肺成纤维细胞在肺纤维化过程中过度合成和释放MCP-1,凝血酶可进一步促进其过度表达MCP-1。

增生性瘢痕成纤维细胞生长特性的研究

目的 :研究增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长特性的差异。方法 :应用消化法建立成纤维细胞系 ,在倒置相差显微镜下观察细胞形态 ,应用细胞计数方法绘制细胞生长曲线 ,测定细胞生长速度。结果 :增生性瘢痕成纤维细胞比正常皮肤成纤维细胞胞体大 ,形态不规则。前者细胞倍增时间约为 6d ,后者细胞倍增时间为 3d。细胞融合后前者细胞数为后者的 5 6%。结论

缝隙连接蛋白26在肺腺癌相关成纤维细胞中的表达及临床意义

目的探讨缝隙连接蛋白26(connexin 26,Cx26)在肺腺癌相关成纤维细胞中的表达及其临床意义。方法收集2018年11月至2019年5月于广西医科大学附属肿瘤医院6例手术切除肺腺癌癌组织及相应癌旁组织,分离原代肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)和正常肺成纤维细胞(normal lung fibroblasts,NLFs);采用光学显微镜观察细胞形态,并结合Western blot和细胞免疫荧光染色检测CAFs标志物α-SMA、E-cadherin和Vimentin的表达,鉴定原代成纤维细胞;qRT-PCR检测Cx26 mRNA表达水平。组织免疫荧光染色法检测Cx26在2013年1月至2018年12月收集的22例肺腺癌癌及癌旁组织中的分布及表达情况。结果成功分离原代CAFs和NLFs,镜下可见细胞呈纺锤形,两者均表达α-SMA、Vimentin,但仅微量表达E-cadherin,且CAFs较NLFs高表达α-SMA(P<0.001)。qRT-PCR检测结果显示,Cx26表达水平在CAFs中随肿瘤分期增加呈持续下调趋势(t=5.684,P=0.011);组织免疫荧光染色检测结果显示,Cx26在肺腺癌组织中的表达低于癌旁组织(t=2.609,P=0.016)。结论肿瘤微环境中CAFs的Cx26表达下调可能与肺腺癌更高分期及恶性进展有关。

维通注射剂对大鼠腹膜正常与粘连成纤维细胞增殖活性与细胞周期的影响

目的:研究维通注射剂(Weitong injection,WTI)对大鼠腹膜正常成纤维细胞(normal fibroblast,NFB)与粘连成纤维细胞(adhesive fibroblast,AFB)增殖活性与细胞周期的影响。方法:利用原代培养获得大鼠NFB与AFB,以地塞米松为阳性对照药,采用MTT法和流式细胞术考察WTI对2种成纤维细胞(fibro-blast,FB)增殖活性与细胞周期的影响。结果:WTI对AFB的半数抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50)显著低于NFB(P<0.01),WTI对2种FB的IC50均显著低于地塞米松(P<0.01);WTI高、中剂量组和地塞米松组的AFB G0/G1期比例显著高于AFB空白对照组(P<0.01),S期比例显著低于AFB空白对照组(P<0.01);WTI高、中剂量组AFB的G0/G1期比例显著高于地塞米松组(P<0.01);各药物组的NFB细胞周期与空白对照组相比无显著性差异。结论:WTI通过将AFB停滞于G0与G1期,延缓其进入S期,抑制AFB增殖活性,WTI对AFB的作用强于NFB。

卵巢癌相关成纤维细胞和正常卵巢成纤维细胞的基因表达差异

目的:对卵巢癌相关成纤维细胞(Carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)及卵巢正常成纤维细胞(Normalfibroblasts,NFs)进行分离、培养、纯化,并分析两者多种基因表达的差异。方法:①用组织块贴壁培养法获得原代卵巢癌CAFs和卵巢NFs,通过胰酶消化法和反复传代法进行细胞的纯化;②观察细胞形态,多种基因的免疫细胞化学染色检测及相应mRNA的半定量分析,对CAFs和NFs进行初步鉴定;③应用RT-PCR的方法对CAFs和NFs中多种基因进行分析比较。结果:①获得了纯化的卵巢CAFs和NFs;②卵巢CAFs的细胞免疫化学染色α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色呈阳性,角蛋白呈阴性,卵巢NFs波形蛋白(Vimentin)阳性,而α-SMA和细胞角蛋白阴性;③卵巢CAFs与NFs中Vimentin与α-SMA的mRNA发现均有表达,但CAFs中表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);④与NFs相比,CAFs中多种mRNA的表达增加,其中包括生长因子,血管生成促进因子,细胞因子等。结论:与NFs相比,CAFs在mRNA、蛋白表达等方面均有统计学差异;卵巢癌中CAFs基因表达的检测表明,其基因表达有显著变化,提示这些成纤维细胞可能为卵巢癌细胞的生长提供了最适合的微环境。推测卵巢-宿主界面微环境在上皮性卵巢癌的发展中可能起重要作用。