Fas死亡信号激发域cDNA的克隆、表达及体外生物学效应

目的 :克隆及表达Fas死亡信号激发域 (FasActivationDomain ,FasAD)片段 ,获得具有生物学活性的FasAD多肽。方法 :应用半巢式逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR)扩增Fas死亡信号激发域cDNA片段 ,构建Intein表达型原核表达载体FasAD pTYB12 ,应用IMPACTTM CN系统表达及进行一步法亲合层析分离、纯化FasAD多肽。结果 :DNA序列测定显示克隆的FasADcDNA碱基排列顺序与Genebank(M6 74 5 4 )所示完全一致。重组表达载体FasAD pTYB12经IPTG诱导 ,成功表达可溶性融合蛋白 ,进一步分离、纯化获得分子量约 5 0 0 0的FasAD多肽 ,Westemblot显示FasAD多肽能被兔抗人Fas多抗识别。初步的生物学活性鉴定显示 ,该FasAD多肽抑制rhFasL诱导的细胞凋亡的生物学活性最高可达 70 %。结论 :可利用IMPACTTM CN系统制备Fas死亡信号激发域的小分子量多肽 ,为深入研究Fas结构与功能的关系及与配体的相互作用提供了相关的实验基础 ,为进一步开发相关的生物免疫调节剂提供了实验依据。

融合表达Fas死亡信号激发域的重组载体FasAD-pTYB2的构建

目的构建融合表达Fas死亡信号激发域(Fasactivationdomain,FasAD)的重组载体FasAD-pTYB2。方法应用半巢式逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)技术克隆Fas死亡信号激发域cDNA片段FasAD,插入通用载体pGEM-T中鉴定,然后装入Intein表达型原核载体pTYB2中,经IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)诱导表达融合蛋白。结果DNA序列测定显示克隆的cDNA片段序列正确。初步获得融合蛋白的表达,经Western-blotting鉴定,融合蛋白具有良好的Fas抗原性。结论上述结果提示可利用该表达型重组质粒制备人Fas死亡信号激发域多肽/intein的融合蛋白。