肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白在暴发型肝衰竭肝组织中的表达

目的 研究肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白 (TRADD)在暴发性肝衰竭小鼠动物模型肝组织中的表达、分布及在发病机制中的作用。方法 尾静脉注射肿瘤坏死因子α(TNFα)于D 氨基半乳糖 (GalN)致敏的BALB/c小鼠 ,造成暴发性肝衰竭模型 ,用脱氧核糖核酸转移酶介导的缺口原位末端标记 (ISEL )技术、琼脂糖凝胶电泳检测肝组织DNA梯带观察肝细胞凋亡 ,Envision两步免疫组织化学方法检测TRADD蛋白在肝组织中的表达及分布。结果 对照组、GalN组和TNFα组肝细胞各时点基本没有或有少量TRADD蛋白表达 ,而GalN +TNFα组在 3 .5h时点就有明显表达 ,此时肝细胞凋亡不明显 ,6h时点TRADD蛋白表达最为明显 ,9h时点 ,肝细胞凋亡和坏死非常明显 ,而TRADD蛋白表达虽然很明显 ,但低于 6h时点。TRADD蛋白阳性率分别为 1.3 % ( 1.5h)、3 .0 % ( 3 .5h)、2 3 .4% ( 6h)和 18.6% ( 9h)。结论 TNFα介导的小鼠暴发性肝衰竭动物模型中 ,TRADD蛋白表达增加 ,TRADD蛋白表达先于肝细胞凋亡 ,TRADD蛋白表达和肝细胞凋亡在一定程度上呈正相关 ,提示TNFα通过上调TRADD蛋白表达介导肝细胞凋亡和坏死进而诱发暴发性肝衰竭。

Fas相关死亡域蛋白在增生性瘢痕组织中原位表达及意义

目的探讨Fas相关死亡域蛋白(FADD)在增生性瘢痕(HS)各个时期的表达变化以及与HS演变的关系。方法采用原位杂交与图像分析系统相结合的方法,定量观察FADD在HS各个时期的表达变化。结果FADD在HS成熟期的表达量是增殖期的2倍,是消退期的5倍;FADD阳性信号主要见于表皮棘层、真皮网状层,以及部分血管。结论FADD表达与增生性瘢痕演变密切相关。

Fas死亡结构域相关蛋白对颈动脉成形术后大鼠血管狭窄和平滑肌细胞增殖的影响

目的:探讨大鼠颈动脉成形术后,死亡域相关蛋白(death domain-associated protein,DAXX)对损伤后血管狭窄和平滑肌细胞增殖的影响及其机制。方法:将32只SD大鼠随机分为4组:假手术组、手术组、空转染组、转染组。所有动物暴露颈动脉,假手术组仅游离颈总动脉,手术组采用球囊扩张损伤大鼠左颈总动脉,空转染组及转染组在此基础上局部运用脂质体转染DAXX空质粒或DAXX质粒,于术后7,14 d分别取各组大鼠左颈总动脉行HE染色,观察并测量内膜、中膜的面积比;免疫组织化学和PCR检测平滑肌中DAXX及氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase,JNK)的表达。结果:术后7,14 d手术组均出现血管管腔狭窄,管壁增厚,血管平滑肌细胞增殖明显(P<0.01);转染组管腔狭窄程度、平滑肌细胞数、血管内膜/中膜面积比值中较手术组明显降低(P<0.01)。手术组平滑肌细胞中DAXX及JNK的蛋白及m RNA表达较假手术组均有所增多(P<0.01),而转染组DAXX,JNK的表达上调程度更为显著(P<0.01)。结论:DAXX局部高表达能有效抑制球囊扩张术后大鼠颈动脉平滑肌细胞增殖,减轻血管狭窄,其作用机制可能与DAXX–JNK通路相关。

Fas相关死亡域蛋白表达与增生性瘢痕演变的关系(英文)

目的探讨Fas相关死亡域蛋白(FADD)在增生性瘢痕(HS)各个时期的表达变化以及与HS演变的关系。方法采用原位杂交与图象分析系统相结合的方法,定量观察FADD(2份,取自同一部位样本)在HS增殖期、成熟期和消退期的表达分布及表达量。结果FADD在HS成熟期的表达量犤面度(9.36±0.92),平均光密度(1154±68)〗是增殖期犤面度(4.72±0.35),平均光密度(552±32)〗的2倍,是消退期犤面度(1.88±0.12),平均光密度(218±16)〗的5倍;FADD阳性信号主要见于表皮棘层、真皮网状层,以及部分血管。结论FADD表达与增生性瘢痕演变密切相关。

Fas相关死亡域蛋白在肝细胞凋亡研究中的意义

Fas相关死亡域蛋白 (FADD)为近年发现的凋亡相关蛋白 ,文章从介绍FADD的基因组结构、蛋白质分子结构、基本生物功能等入手 ,进一步概括总结与FADD相关的肝细胞凋亡的研究进展 。

非小细胞肺癌中FADD蛋白的表达及与细胞凋亡蛋白P53的关系

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中Fas相关死亡域蛋白(FADD)的表达及与细胞凋亡蛋白P53关系。方法采用免疫组化方法分别检测61例肺癌组织和30例癌旁正常组织中的FADD和P53表达,然后进行比较。结果 61例肺癌组织中FADD蛋白阳性率为88.52%,30例癌旁正常组织中FADD蛋白阳性率96.67%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);而61例肺癌组织中P53蛋白阳性率为75.41%,明显高于30例癌旁组织(0.00%),差异具有统计学意义(P<0.01)。在61例肺癌组织中FADD蛋白与P53蛋白表达具有较好的相关性(χ2=12.56,P<0.01)。在NSCLC中FADD蛋白及P53蛋白的表达与患者的年龄、性别、吸烟史、临床分型、病理类型、淋巴结转移、肿瘤直径等指标无明显的关系(P>0.05),而与NSCLC的分化程度、TNM分期有关(P<0.01)。结论 FADD蛋白与P53蛋白在NSCLC中表达具有良好的一致性,检测手术后肺癌组织的FADD和P53蛋白表达水平,可作为评估NSCLC预后情况的手段之一。

促红细胞生成素对脑出血大鼠脑血肿周围Fas相关死亡域蛋白和Caspase-8表达的影响

目的研究大鼠脑出血不同时期Fas相关死亡域蛋白（FADD）和Caspase-8表达及促红细胞生成素（EPO）对其的影响，探讨EPO的脑保护机制。方法sD雄性大鼠126只随机分为假手术组、脑出血组、EPO干预组各42只，各组又按不同时间点分为术后3、6、12、24、48、72h和7d共7个亚组（每个亚组6只）。采用自体血脑内注射法建立脑出血动物模型，应用免疫组化方法检测脑出血后不同时间点血肿周边脑组织中FADD和Caspase．8表达情况。结果脑出血后3hFADD和Caspase-8升高[分别为（4．66±0．46）和（15．89±1．81）]，48h达到高峰[分别为（35．88±4．24）和（45．04±3．99）]，与脑出血组比较，EPO干预组3h和48h的FADD和Caspase-8表达显著减少[分别为（3．92±0．64）和（28．24±1．90）、（13．32±2．01）和（35．08±2．85）]。结论脑出血后血肿周围细胞FADD和Caspase-8表达明显增多，EPO可能通过抑制FADD和Caspase-8的表达，对脑出血后脑组织有保护作用。

外胚层发育不良蛋白-A受体相关死亡域在前列腺癌中的表达及其对细胞增殖、侵袭的影响

目的检测外胚层发育不良蛋白-A受体相关死亡域(EDARADD)在前列腺癌组织及细胞中的表达水平,探讨EDARADD对前列腺癌细胞生物学功能的影响及其机制。方法收集郑州大学第一附属医院泌尿外科2013年1月1日至2019年1月1日前列腺癌根治术石蜡病理121例,配对癌旁组织石蜡病理50例,采用免疫组织化学检测前列腺癌患者及正常前列腺组织中EDARADD蛋白的表达水平,并分析EDARADD表达与患者预后的关系。在前列腺癌细胞系DU145中转染小干扰RNA(siRNA)-EDARADD,将细胞分为对照组(shctrl)及转染组(shEDARADD)采用蛋白质印迹法(Western blot)验证转染效率。采用荧光细胞增殖实验检测细胞增殖能力,采用Matrigel检测细胞侵袭能力。采用Western blot检测蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)表达水平,两组间比较采用t检验。结果免疫组织化学显示EDARADD在前列腺癌中表达水平显著高于正常前列腺组织,且表达水平与肿瘤恶性程度呈正相关(χ^(2)=6.770,P<0.05)。EDARADD与前列腺癌患者无生化复发生存期负相关[(59.992±5.079)个月比(44.517±6.125)个月,χ^(2)=8.251,P<0.05],shEDARADD转染成功后,对照组在3、5 d时细胞增殖数目高于转染组[DU145细胞系shctrl比shEDARADD1为,3 d:(396.00±36.71)个比(80.67±11.24)个;5 d:(1747.30±110.29)个比(185.33±3.51)个,t=14.221、24.522,P<0.05;shctrl比shEDARADD2为,3 d:(396.00±36.71)个比(91.33±6.50)个;5 d:(1747.30±110.29)个比(270.67±18.58)个,t=14.152、22.872,P<0.05]。Matrigel实验中对照组侵袭细胞数目高于转染组[DU145细胞系shctrl比shEDARADD1为(123.50±13.01)个比(15.71±5.47)个,t=20.322,P<0.01;shctrl比shEDARADD2为(123.50±13.01)个比(15.14±4.30)个,t=20.962,P<0.05];Western blot实验显示转染组p-Akt及p-mTOR表达水平显著降低。结论EDARADD在前列腺癌组织中异常高表达,可作为癌基因促进前列腺癌发生发展。

利用酵母双杂交系统筛选TRADD的互作牛分枝杆菌蛋白

为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白(TRADD)相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×10~6 CFU,平均插入片段在1.5kb左右,文库重组率>95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。

TRADD基因转染增生性瘢痕与瘢痕疙瘩成纤维细胞并诱导其凋亡的实验研究

目的探讨含有TRADD基因的重组腺病毒转染增生性瘢痕成纤维细胞与瘢痕疙瘩成纤维细胞,对纤维细胞凋亡特性的影响。方法利用分子克隆技术将TRADD基因转入Adeasy腺病毒载体中,经TNF预处理后,用重组腺病毒转染正常皮肤成纤维细胞、增生性瘢痕成纤维细胞与瘢痕疙瘩成纤维细胞,观察其对3种细胞凋亡率的影响。利用生长曲线、流式细胞仪检测转染前后3种成纤维细胞凋亡的情况。结果含有TRADD基因的腺病毒载体转染增生性瘢痕成纤维细胞与瘢痕疙瘩成纤维细胞后,细胞生长速度变慢,流式细胞仪显示细胞凋亡率增加。结论在TNF预处理的情况下,TRADD能提高增生性瘢痕成纤维细胞与瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡率。

超负荷血糖对鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及FADD、Daxx表达的影响

目的观察超负荷血糖对大鼠脑缺血再灌注缺血半暗带侧皮质区FADD、Daxx表达的影响,进一步探讨超负荷血糖加重脑缺血再灌注损伤的分子机制。方法SD大鼠腹腔内注射链脲佐菌素(STZ),建立糖尿病高血糖大鼠模型,之后应用栓线法建立大鼠脑缺血再灌注模型。随机分为三大组:假手术组(A)、脑缺血再灌注组(B)和糖尿病脑缺血再灌注组(C)。于缺血1h再灌注12h行神经功能评分,TTC染色测梗死面积,Tunel法检测细胞凋亡数目,免疫组化及Western blot检测FADD、Daxx的表达,并进行图像分析。结果糖尿病脑缺血再灌注组的神经功能评分为(3.50±0.55),梗死面积为(39.99±2.23),细胞凋亡数为(27.51±3.43),免疫组化检测FADD为(110.18±4.21)、Daxx为(101.26±3.27);Western blot检测FADD为(1.191±0.041),Daxx为(1.389±0.052)。脑缺血再灌注组的神经功能评分为(2.67±0.81),梗死面积为(30.13±2.04),细胞凋亡数为(18.28±2.09),免疫组化检测FADD为(131.46±3.24),Daxx为(123.16±2.19);Western blot检测FADD为(1.035±0.032),Daxx为(1.146±0.083)。与脑缺血再灌注组相比,糖尿病脑缺血再灌注组的神经功能评分、梗死面积、细胞凋亡数、FADD及Daxx蛋白表达均明显增加(P<0.05)。结论FADD、Daxx可能参与了超负荷血糖加重脑缺血再灌注损伤过程,上调FADD、Daxx表达可能是超负荷血糖加重脑缺血再灌注损伤的机制之一。

纳洛酮对脑出血大鼠脑血肿周围FADD表达及脑水肿的影响

目的研究大鼠脑出血不同时期Fas相关死亡域蛋白(FADD)表达和脑水肿及纳洛酮对其的影响,探讨纳洛酮脑保护机制。方法 126只SD雄性大鼠随机分为假手术组、脑出血组、纳洛酮治疗组,每组42只采用自体血脑内注射法建立脑出血动物模型,应用免疫组化方法检测脑出血后不同时间点血肿周边脑组中FADD表达情况,干湿比重法测脑水肿。结果出血后3hFADD和脑水肿升高,48～72h达到高峰,与脑出血组比较纳洛酮治疗组FADD和脑水肿表达显著减少(P<0.01)。结论脑出血后血肿周围细胞FADD表达和脑水肿明显增多,纳洛酮可能通过抑制FADD的表达,减轻脑水肿,对脑出血后脑组织有保护作用。

TRADD基因外显子的拼接及重组腺病毒的构建

目的构建含有人TRADD基因片段的重组腺病毒载体。方法从人肝组织中提取总RNA,逆转录得到cDNA。按照TRADD基因4个外显子的基因序列设计引物,分别扩增得到4个外显子的基因片段。对4个外显子进行基因拼接,得到全长的TRADD片段。利用AdEasy系统构建TRADD重组腺病毒,测定病毒滴度,并转染成纤维细胞。结果拼接成功939kb的TRADD基因,行PCR扩增重组腺病毒中TRADD基因,在略小于1000kb处见到明显的TRADD条带。结论构建成功的含有TRADD基因片段的重组腺病毒,可用于转染人成纤维细胞,用于检测TRADD对病理性瘢痕成纤维细胞的影响。

马氏珠母贝TRADD基因克隆与组织表达分析

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TRADD)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝PmTRADD基因的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmTRADD基因在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmTRADD包含5′非编码区101bp,3′非编码区144bp和开放阅读框(ORF)591bp,编码196个氨基酸。序列分析表明,PmTRADD没有信号肽和跨膜结构域,C端含有一个死亡结构域(DEATH)。将PmTRADD死亡结构域的氨基酸序列与其他物种的TRADD死亡结构域序列进行比对,发现不同物种的TRADD死亡结构域序列同源性较低。PmTRADD在马氏珠母贝各组织中均有不同程度表达,在鳃组织中表达最高,肝胰腺次之,闭壳肌中基本无表达。

FADD敲除增强A549细胞对依托泊苷的敏感性

本文主要探究Fas相关死亡域蛋白(Fas-associated death domain protein, FADD)敲除后,化疗抗癌药物依托泊苷(etoposide, VP16)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC) A549细胞在增殖、迁移和凋亡方面的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建了FADD敲除A549 (FADD KO A549)及其对照(control A549)细胞。采用CCK-8法检测不同浓度的依托泊苷对control A549细胞和FADD KO A549细胞活力的抑制作用;采用划痕实验检测两株细胞的迁移情况,比较依托泊苷对两株细胞迁移的抑制作用;采用流式细胞术检测两株细胞的凋亡情况,比较依托泊苷对二者凋亡的促进作用。Western blot检测增殖蛋白[c-Raf (raf proto-oncogene serine/threonine-protein kinase)和p-ERK (extracellular signal-regulated kinase of phosphorylation)]、凋亡蛋白[BCL2 (B-cell lymphoma 2)、cleavedcaspase-3 (cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3)以及cleaved-caspase-9]和迁移蛋白[MMP2 (matrix metalloproteinase 2)]的表达变化。结果显示,与control A549细胞相比, FADD KO A549细胞迁移和增殖能力减弱,凋亡增加,且对依托泊苷的敏感性增加;c-Raf、p-ERK、MMP2和BCL2蛋白减弱趋势显著;cleaved-caspase-3和cleavedcaspase-9蛋白增加趋势显著。结合GEPIA数据库得到的Kaplan-Meier (KM)生存曲线分析,初步判断在肺腺癌中FADD基因水平高的患者预后不良。本文提示, FADD可作为肺腺癌治疗潜在的生物标志物,为肺腺癌治疗提供个性化治疗方案。