流式细胞术检测结核分枝杆菌死活菌混合样本中活菌比例的研究

目的探讨利用基于荧光素二乙酸酯(FDA)的流式细胞术检测结核分枝杆菌(MTB)混合菌液中活菌比例的性能,为应用流式细胞术定量检测与分析MTB异质性耐药方法的创建提供实验依据。方法将10株1麦氏浊度MTB纯培养活菌悬液和其相应的1麦氏浊度85℃加热30 min处死的MTB菌液按一定比例混合得到MTB死活菌混合菌液(其中活菌比例分别为100%、75%、50%、25%和0%),应用FDA分别对其进行染色后,流式细胞仪检测其平均荧光强度(MFI),求其与对应100%活菌样本MFI值的比值来模拟MTB异质性耐药检验中的FDA敏感指数,双变量直线回归分析得到敏感指数与实际活菌比例之间的直线回归方程,并利用该方程计算另外10组死活菌混合菌液样本中MTB活菌比例。结果(1)死菌与活菌MTB样本经FDA染色后MFI值比较差异有统计学意义(P<0.05),该方法用于区分死菌与活菌的界值为1834,用该界值鉴定其余20个死、活未知的MTB样本,其检测的灵敏度为100%、特异度为100%。FDA染色能够明确鉴别MTB的死、活。(2)10组已知活菌比例的MTB死活菌混合菌液样本经FDA染色后各比例之间MFI值比较差异有统计学意义(P<0.05),敏感指数(Y)与混合样本中活菌比例(X)之间的直线回归方程:Ŷ=0.986X+0.016,该直线回归方程差异有统计学意义(P=0.000)。(3)应用这种染色方法对其余50个MTB死活菌混合菌液样本进行检测,计算活菌比例与实际活菌比例之间差异无统计学意义(P>0.05),基于FDA染色方法的流式细胞术可用于MTB死活菌混合菌液样本中活菌比例的检测。结论通过基于FDA染色的流式细胞术具有准确检测MTB混合菌液样本中活菌比例的潜力,该方法在MTB异质性耐药检测中将具有广阔的应用前景。

实时荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌活菌

沙门氏菌是引起食物中毒的最常见致病菌,而基于DNA水平的常规PCR(DNA-PCR)检测法虽然快速、灵敏,但在检测时无法区分死活菌,死亡的细菌会出现假阳性结果,严重影响日常检测结果的判断。提取沙门氏菌总RNA之后,采用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以沙门氏菌invAmRNA为检测对象,发现只有活的沙门氏菌显阳性,死亡的沙门氏菌呈阴性。而且RT-PCR法的稳定性良好,能够准确定量活的沙门氏菌,在纯培养时,检出限可达1CFU/3mL。实验表明,建立的RT-PCR法是一种能够快速、精确检测沙门氏菌活菌的方法。

实时逆转录聚合酶链式反应检测活的金黄色葡萄球菌

针对基于DNA水平的聚合酶链式反应(DNA-PCR)检测食品中金黄色葡萄球菌时会出现假阳性结果的缺点,建立一种能够区分死、活金黄色葡萄球菌的检测方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因,自设计Taqman探针、引物,采用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以femA mRNA为检测对象,发现只有活的金黄色葡萄球菌显阳性,死亡的则呈阴性;纯培养时,重复检测变异系数为0.15,灵敏度为9×102CFU/mL,检出限可达1/3 CFU/3 mL。实验表明,该研究所建立的一步法逆转录聚合酶链式反应检测法,不仅灵敏度高、特异性强,而且能够有效地区分死、活金黄色葡萄球菌。