超临界CO_2破壁对米糠及米糠油提取的影响

通过超临界CO_2破壁方式对新鲜米糠进行预处理,考察破壁压力、破壁温度和破壁时间3个因素对米糠的过氧化物酶残余活性、微观结构和萃取米糠油时间的影响。结果表明:在破壁压力20 MPa、破壁温度50℃、破壁时间20 min的条件下,过氧化物酶残余活性为14.23%,出油率为13.99%。同时把经过预处理的米糠与未处理的米糠进行超临界CO_2萃取米糠油试验,对比发现,经过预处理的米糠在30 min内萃取出80%~90%的油脂,没有经过预处理的米糠30 min内萃取出40%~50%的油脂。

苯丙氨酸羟化酶基因G247S、E280G、P362T和A434D突变的体外表达研究和结构分析

目的探讨苯丙氨酸羟化酶基因4种新错义突变G247S、E280G、P362T和A434D的致病性质以及与临床表型之间的关系。方法（1）应用体外真核表达体系进行突变体蛋白的瞬时表达；以野生型苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxide，PAH）的酶活性作为参照，计算突变体的残余酶活性。（2）比对不同种属的PAH酶蛋白序列，分析这些突变位点的氨基酸的保守性。（3）以正常PAH蛋白的晶体结构为基础，应用生物大分子结构模拟软件进行突变位点的三维结构分析，预测氨基酸的替换对酶功能的潜在影响。（4）根据治疗前血苯丙氨酸浓度和饮食苯丙氨酸的耐受量，进行苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）患儿的临床表型分析。结果（1）突变体G247S、E280G、P362T和A434D体外表达的残余酶活性分别为野生型的3．1％、0．4％、8．2％和21．7％。（2）Gly247、G1u280、Pr0362均属于高度保守的氨基酸残基位点，而Ala434则属于比较保守的位点。（3）三维分子结构分析显示G2A,7S和E280G位于酶的活性中心位置，可能分别影响PAH酶与四氢生物蝶呤和铁离子的结合；而突变P362T和A434D则可能分别影响PAH酶二聚体和四聚体化的形成和稳定性。（4）临床表型分析显示携带G247S和E280G突变的患者为经典型PKU，携带P362T的患者既有经典型PKU也有中间型PKU，携带A434D患者均为中间型PKU。结论（1）E280G、G247S、P362T和A434D突变均为致病性的突变，位于酶活性中心位点的突变影响酶的活性功能更为明显。（2）突变酶分子的结构分析以及对酶功能影响的预测与体外表达的实验结果基本一致。（3）突变基因型、体外表达活性实验以及临床表型之间的关联分析存在着一定的关联性。

苯丙氨酸羟化酶基因突变的体外表达分析

目的对苯丙氨酸羟化酶（phenylalaninehydroxylase，PAH）基因7种突变（R270G、P275A、F121L、A156P、E183G、1324N和R408Q）进行功能分析，通过检测其蛋白表达及酶活性的变化，探讨突变效应和致病性质，进一步明确基因型和表型之间的关系。方法（1）应用体外定点诱变技术构建含有7种突变型PAHcDNA的表达载体，转化感受态大肠杆菌，提取质粒并测序验证。（2）将含有野生型和突变型PAHcDNA的真核表达载体pcDNA3．0瞬时转染COS-7细胞，转染48h后提取总蛋白，应用免疫印迹法检测蛋白表达量并进行酶活性分析。以野生型PAH作为参照，计算突变型PAH的蛋白表达量、残余酶活性。结果R270G、P275A、F121L、A156P、E183G、1324N和R408Q突变型PAH的蛋白表达量分别为野生型的10．5％，56．6％，54．3％，8．70o，8．5％，67．3％和85．4％。体外表达酶活性分别为野生型的7．7％，27．6％，19．0％，10．4％，9．1％，50．6％和40．2％。结论7种突变型PAH的体外表达量及酶活性相对于野生型均有明显降低，证实这7种突变均为引起PAH酶活性降低的致病性突变。