应用荧光法测定重组细胞因子中残余DNA含量

目的:建立荧光微量 DNA 含量测定方法,用于重组细胞因子的质量控制。方法:应用 PicoGreen 荧光试剂与 DNA 结合能产生可激发荧光的复合物、再用荧光酶标仪对复合物进行检测并用 SOFTmaxPRO 分析软件进行分析。结果:该荧光法 DNA检测灵敏度达到312 pg·mL^(-1),DNA 含量在0.31～80n·mL^(-1)范围内线性良好,r≥0.996。应用该法对7种重组细胞因子共13批制品的外源 DNA 含量进行测定,结果表明:除重组人 BMP 和 IL-11以外,其它重组细胞因子 DNA 含量均小于10ng·剂量^(-1),与地高辛标记的 DNA 杂交试验结果基本一致。结论:该方法具有简便、快速、自动化程度高等特点,可用于重组细胞因子残余外源 DNA 含量的常规检定。

地高辛标记探针检测重组人肿瘤坏死因子α衍生物中残余DNA

本文用地高辛标记工程菌ＤＮＡ片段作探针，通过分子杂交和免疫显色检测ｒ－ｈＴＮＦαＤ半成品和制剂中的残余ＤＮＡ。该法对半成品和制剂分别采用蛋白酶Ｋ膜后处理和酚与氯仿抽提方法，消除了蛋白质或甘露醇对ＤＮＡ测定的干扰。本法特异、准确，灵敏度达１ｐｇ／点。用此法测定３批ｒ－ｈＴＮＦαＤ半成品和制剂（ｎ＝５），其残余ＤＮＡ均小于１００ｐｇ／剂量且重复性较好。

DOP-PCR法检测单抗残余DNA的探讨

目的：利用简并引物（Degenerate Oligonucleotide-Primed，DOP）PCR法，建立一种物种非特异性的宿主细胞残余DNA检测方法。方法：设计简并引物，优化实时定量PCR的条件，从而建立DOP--PCR法，检测5种重组单抗药物宿主细胞表达系统（CHO细胞、SP2／0细胞和NS0细胞）的残余DNA。结果：简并引物选择51Tag—N6-ATGTGG 3’，定量PCR条件优化为：低严谨性扩增的退火温度由；32℃以3％的斜率升至72℃，严谨性扩增后的荧光检测条件优化为77℃，30s。3个物种的DNA扩增曲线R2均能达到0．99以上，回收率达到80％～132％，3次测定的ESD均小于25％。同时DOP-PCR与CHO细胞特异性的定量PCR进行比较，二者回收率的均值均在80％～130％之间，3次测定的RSD均小于20％。结论：初步建立了物种非特异性的宿主细胞残余DNA的DOP-PCR检测方法，为单抗药物宿主细胞残余DNA检测提供新思路。

重组人组织型纤溶酶原激活剂中细胞残余DNA的检测

采用地高辛标记探针 ,以核酸分子斑点杂交技术检测重组人组织型纤溶酶原激活剂 (rt PA)中细胞残余DNA的方法。从样品中去掉蛋白提取DNA的方法能有效的避免蛋白对检测结果的干扰 ,其灵敏度和结果都能较好地达到WHO的要求。

重组大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ中残余DNA的检测

用地高辛标记工程菌DNA片断作探针 ,通过分子杂交和免疫显色检测重组天冬酰胺酶半成品中的残余DNA。该法对半成品用氯仿抽提 ,消除了蛋白质对DNA测定的干扰。 3批重组门冬酰胺酶半成品的测定结果表明 ,其残余DNA均小于 10 0 pg/剂量。

地高辛标记探针检测生物制品中残余DNA含量

用地高辛标记探针检测由传代细胞系生产的人用精制狂犬病疫苗、重组 (CHO细胞 )乙肝疫苗、出血热疫苗及痢疾多糖结合疫苗原液中残余DNA含量。结果表明 ,该方法特异性强 ,灵敏度高 。

重组白细胞介素2制品外源残余DNA的检测

采用ＤＮＡ杂交技术，用３２Ｐ标记的探针检测重组白细胞介素２制品的外源ＤＮＡ残余量。设三个水平：２５个剂量、１５个剂量、５个剂量。结果提示该方法是一种敏感有效的检测方法，其最小用样量为５个剂量单位。这为新制品检测方法的建立提供依据。

地高辛标记探针检测Vero细胞残余DNA试验条件的改进

目前，应用地高辛标记探针检测Veto细胞残余DNA含量仍是最常用的检测方法，该方法具有特异性强、无放射污染、操作简便等特点。在实际操作中，地高辛探针的灵敏度及杂交的条件对检测结果均有很大的影响。为此，我们就提高探针灵敏度及优化杂交条件进行了摸索。

人用狂犬病疫苗(Vero细胞)宿主残余DNA qPCR检测方法的建立及验证

目的建立能够进行定性及定量分析的人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液宿主残余DNA检测的qPCR法,并进行验证。方法用Vero细胞DNA定量国家标准品建立qPCR标准曲线,磁珠法提取Vero细胞残余DNA。对该方法进行专属性、重复性、中间精密度、准确度及耐用性验证,并确立线性范围及定量限。用该方法对3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液残余DNA进行定量分析及片段大小定性分析。结果采用qPCR法检测Vero细胞DNA定量国家标准品,标准曲线相关系数(R^(2))均>0.99,DNA检测范围为0.3 pg/mL~30 ng/mL。该方法专属性、重复性好,中间精密度、准确度及耐用性验证中,样品检测结果的相对标准偏差(RSD)均<10%。3批原液Vero细胞残余DNA含量为0.20~0.77 ng/剂,符合《中国药典》三部(2020版)相关标准;残余DNA>154 bp的片段占52%~63%。结论建立的方法专属性、重复性、中间精密度、耐用性好,可快速、准确地进行残余DNA的定性及定量分析,对人用狂犬病疫苗(Vero细胞)生产过程中和最终产品残余DNA含量的检测及控制具有重要意义。

荧光法和DNA杂交法检测重组技术产品中残余DNA的比较

目的:对用于检测重组技术产品中残余DNA的荧光法及DNA杂交法进行比较性评价。方法:应用地高辛标记的DNA杂交法以及PicoGreen荧光法对3批重组人干扰素α2b中外源DNA残留量进行测定。结果:荧光法检测结果显示3批重组人干扰素α2b制品中DNA残留量分别为每人份剂量(0.695±0.021)ng、(0.664±0.021)ng、(0.916±0.017)ng,而用地高辛标记的DNA杂交实验由于阳性基因组DNA灵敏度偏低以至于结果无法判断。应用琼脂糖凝胶电泳和PicoGreen荧光法测得由生产单位提供的阳性DNA浓度明显偏低,与标示量不符,这说明阳性DNA含量偏低是本次DNA杂交实验失败的主要原因。通过对该阳性DNA重新定量后再进行DNA杂交检测,结果显示3批重组人干扰素α2b制品的DNA残留量均小于每人份剂量1ng,该结果与PicoGreen荧光法相一致。结论:荧光法具有简便、快速,自动化程度高,不受工程菌种类限制,能够精确定量等特点,优于传统的DNA杂交法,更适于重组制品残余外源DNA含量的常规检定。

TaqMan MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA方法的适用性验证及应用

目的对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行适用性验证及应用。方法对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,并应用该方法检测3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液、纯化液和原液中Vero细胞残余DNA含量,计算Vero细胞残余DNA去除率。结果 Taq Man MGB探针实时定量PCR能够特异性扩增Vero细胞基因组DNA长串连重复序列;DNA浓度在10-1~10-6 ng/μl范围内标准曲线线性良好,相关系数为0.996,扩增效率为93.54%;检测灵敏度为10-6 ng/μl,高于斑点杂交法;检测高（10-2 ng/μl）、中（10-4 ng/μl）、低（10-6 ng/μl）浓度阳性对照DNA模板的试验内变异系数（CV）为0.145%~3.110%,试验间CV为0.624%~2.359%;检测不同浓度阳性对照DNA的回收率在101.5%~109.4%之间,均在定量方法可接受的回收率范围内;在斑点杂交检测灵敏度范围内,同一样品采用Taq Man MGB探针实时定量PCR法与斑点杂交法半定量检测的结果吻合。3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液纯化后可有效去除Vero细胞残余DNA,总去除率约为100%。结论 Taq Man探针实时定量PCR法特异性、精密性、准确性良好,灵敏度高,可作为斑点杂交法的替代方法,用于实验室内部的质量控制。

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞残余DNA荧光定量PCR检测方法及其相应质量标准的建立

目的建立与国际接轨的Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliovirus vaccine made from Sabin strain,sIPV)Vero细胞残余DNA荧光定量PCR(q-PCR)检测方法及相应质量标准。方法按照《中国药典》三部(2020版)通则3407第三法,选择通则建议的Vero细胞核酸引物和探针,通过优化磁珠法提取核酸以及PCR反应体系和条件,采用q-PCR法Vero细胞DNA定量国家标准品,对sIPV产品进行线性范围、精密度和回收率验证。在此基础上,与国内5家sIPV生产研究企业和2家省药检院协作开展适用性验证的研究,并对检测结果进行统计分析,建立q-PCR法检测sIPV成品Vero细胞DNA残留量的可接受限度标准。结果优化的q-PCR方法在0.002~200 pg/μL范围内呈良好的线性关系,R2=0.999;精密度验证结果试验内、试验间变异系数分别为16.7%和27%;样品回收率在50%~150%范围内,RSD≤30%,符合《中国药典》三部(2020版)通则3407第三法相关要求。协作研究各企业sIPV成品Vero细胞DNA残留量平均为0.07~7.8 pg/剂,检测结果最大值<50 pg/剂,各实验室显示出良好的适用性;用q-PCR法检测已知50 pg Vero细胞核酸标准品(杂交法用),共获得55个有效检测值,统计计算结果为50.00 pg(95%CI:44.00~56.01 pg),与理论值差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功建立了sIPV产品适用的Vero细胞残余DNA q-PCR检测方法,该方法具有良好的适用性,可用于sIPV成品的质量评价,限度标准定为不高于50 pg/剂具有可行性。

生物制剂中残余DNA的潜在危害性及其检测方法的研究进展

残余DNA(residual DNA,rDNA)的监控对多数已上市或正在开发的生物制剂都是必需的。rDNA被视为与宿主相关的不纯物,阐明其潜在的危害性,运用适当方法证明其在工艺过程中被清除到可接受和/或一致性的水平,对生物制剂生产和开发至关重要。本文就rDNA的潜在危害性及其定量检测方法的研究进展作一综述。

茶多酚对HL-60细胞氧化损伤时DNA双链残余率的影响

目的 观察茶多酚对 HL- 60细胞氧化损伤时 DNA双链残余率的影响。方法 采用 DNA荧光解旋法 (FADU)对 DNA双链残余率进行检测。结果 过氧化氢可以对细胞 DNA造成损伤 ,细胞浓度为 1 .5× 1 0 9/ L时 ,过氧化氢浓度在 0 .1～ 0 .5 mmol/ L时与DNA双链残余率有良好的线性关系。茶多酚浓度在 1 0～ 80 mg/ L时过氧化氢诱导的 DNA氧化损伤具有明显的抑制作用 (P<0 .0 5) ,但茶多酚浓度过高 ,DNA双链残余率有减少趋势。结论 过氧化氢可以造成 HL- 60细胞 DNA的氧化损伤 ,茶多酚具有保护细胞 ,抑制DNA氧化断裂程度 ,在一定浓度范围内 ,茶多酚的抗氧化作用与其浓度成正比 ,过高浓度的茶多酚则抗氧化能力下降。

QPCR法与DNA探针杂交法检测重组人生长激素原液中残余DNA的比较

目的对重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)原液中残余DNA检测的实时荧光定量PCR(以下简称QPCR)法和DNA探针杂交法进行对比。方法提取3批rhGH原液中残余DNA,经SYBR GREENⅠ荧光染料法对残余DNA进行QPCR检测,对建立的方法进行准确度、精密度及引物特异性验证,并与《中国药典》三部(2015版)中规定的DNA探针杂交法检测的残余DNA含量进行比较。结果 QPCR法对3批rhGH原液残余DNA含量均可定量,灵敏度可达7. 5 fg。标准品DNA浓度在7. 5 fg/μL～750 pg/μL范围内线性关系良好,R2为0. 998,加标回收率为78. 40%～106. 45%。两种方法检测的3批rhGH原液残余DNA含量均小于《中国药典》三部(2015版)中规定的10 ng/剂量的要求。结论 QPCR法高效快捷,通过DNA与染料结合可实时监控PCR过程中的每一步反应,减小污染,对样品中残余DNA可进行准确定量,比DNA探针杂交法更适用于样品中残余DNA含量的检测。

地高辛标记核酸探针检测重组人白细胞介素1受体颉颃剂中DNA残余量的研究

试验旨在建立重组人白细胞介素1受体颉颃剂(interleukin-1receptor antagonist,IL-1ra)原液中宿主菌DNA残余量的检测方法。以重组白细胞介素1受体颉颃剂工程菌基因组DNA为模板,优化试验条件,借助超声波手段,制备地高辛标记的核酸探针,并以此探针进行狭缝杂交及显色反应。结果显示,在24批次重组人IL-1ra原液中,每人份使用剂量的宿主DNA残余量均小于10ng。结果表明,该方法灵敏度较高、特异性较强、重复性较好、操作步骤安全且较为方便,可用于重组人IL-1ra原液及半成品的DNA残余检测。

实时荧光定量PCR检测工程酵母制备重组单克隆抗体原液中的宿主DNA残余

目的:建立实时荧光定量PCR法检测基于新型工程化酵母制备的重组单克隆抗体原液中残留DNA的含量,完善临床前质量控制研究资料。方法:以毕赤酵母工程菌的基因组DNA作为标准品,选择在毕赤酵母中基因拷贝数高的5S rRNA基因作为检测基因,合成特异性引物;通过优化反应体系、加样回收方法,建立实时荧光定量PCR检测糖基工程酵母宿主DNA残余的方法。结果:优化后的实时荧光定量PCR法检测灵敏度达10^-3 pg/μL,标准品DNA浓度为10^3~10^-3 pg/μL时具有很好的线性关系,R2值达0.9984。不同浓度加样实验回收率为80%~120%,重组单克隆抗体原液的DNA残余量测定结果为2.45 ng/剂量。结论:建立了一种基于实时荧光定量PCR检测糖基工程酵母制备的单克隆抗体的宿主DNA残余的方法。该方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,可满足药典对毕赤酵母生物制品宿主DNA残余量的要求。为糖基工程酵母制备的重组单克隆抗体和其他生物制品的质量控制提供了一种普适性方法。

首批HEK293细胞DNA含量测定国家标准品的制备

目的制备HEK293细胞DNA含量测定用国家标准品,以期为行业内HEK293细胞残余DNA的测定提供支持。方法使用Genomic-tip 500/G以及基因组DNA纯化试剂制备HEK293细胞DNA,以其为标准物质原料,采用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法进行纯度和含量筛选,随后稀释至浓度约为100 ng/μL后,按160μL/支进行分装。组织5家不同实验室,采用紫外分光光度法进行协作标定,并评价其稳定性和适用性。结果制备的HEK293细胞DNA国家标准品经检测,A260/A280均在1.8~2.0之间,电泳图谱为单一条带,符合规定。该标准品经5家实验室协作标定,共得到78个有效数据,平均含量为104.8 ng/μL,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为4.2%,均数的95%可信区间为103.8~105.8 ng/μL,单次测定的95%参考值范围为96.0~113.6 ng/μL,平均可信限率为1.0%,推荐保存条件为-80℃。采用2个不同型号的荧光定量PCR仪进行适用性研究,该标准品在0.3~3000 pg/反应范围内适用性良好,扩增效率分别为101%和95%,标准曲线R^(2)分别为0.9992和0.9995。结论该批HEK293细胞DNA国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品用于荧光定量PCR检测,含量定为104.8 ng/μL,批号为270039-202301。

诺如病毒基因工程疫苗中残余宿主DNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立汉逊酵母表达的重组诺如病毒基因工程疫苗中残余宿主DNA实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法,并进行验证。方法采用磁珠法提取汉逊酵母基因组DNA,获得标准品,建立q PCR标准曲线,并进行专属性、线性、准确度、精密度和耐用性验证。结果专属性验证结果显示,与对照制剂(注射用水、缓冲液、Vero细胞和CHO细胞培养上清DNA)相比,建立的方法对汉逊酵母DNA具有特异性扩增曲线;线性验证中5次试验标准曲线相关系数(R2)均>0.98;准确度验证试验不同浓度样品的加标回收率在95.12%~105.72%之间,均在70%~130%范围内;重复性和中间精密度验证试验相对标准偏差(RSD)均小于30%;耐用性验证中,Proteinase K不同消化温度下检测结果的RSD为20.75%,不同蛋白浓度供试品检测结果的RSD为27.11%,均符合《中国药典》三部(2015版)要求。结论建立的方法专属性、线性、准确度、精密度和耐用性均符合要求,可用于检测重组诺如病毒类病毒颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗中残余宿主DNA。