目的:对CHO宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量检测方法应用于候选治疗性单克隆抗体(以下简称单抗)产品生产过程中质控和放行检测的适用性进行验证。方法:采用荧光标记的二维差异凝胶电泳(2-dimensional difference gel electro...目的:对CHO宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量检测方法应用于候选治疗性单克隆抗体(以下简称单抗)产品生产过程中质控和放行检测的适用性进行验证。方法:采用荧光标记的二维差异凝胶电泳(2-dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)测定羊抗HCP多克隆抗体对空发酵宿主细胞上清中HCP蛋白的覆盖率;采用统计学方法根据40次检测结果确定检出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ);依照人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)Q2要求验证方法特异性、精密性/中间精密性、准确性、线性和耐受性;依照《美国药典》〈1132〉要求验证方法用于过程中质控的适用性、关键HCP清除步骤和各步骤样品测定稀释度范围。结果:2D-DIGE测定羊抗HCP多抗对CHO HCP的覆盖率为56%,应用该抗体建立的CHO HCP检测方法的LOD和LOQ分别为2.47和7.41 ng·mL^(-1)。经验证,方法特异性、精密性/中间精密性、准确性、线性和耐受性均符合要求。系列稀释单抗纯化过程中间产物,采用选定方法进行检测,确定各生产步骤产物HCP测定的稀释范围,计算各纯化步骤的HCP清除率,确定蛋白A亲和层析为HCP的主要清除步骤。根据上述结果,确定所选定的CHO HCP残留量测定方法可做为蛋白A纯化的过程中控制项目和原液的放行项目。结论:所选定CHO HCP检测方法可应用于候选治疗性单抗的过程中控制和放行。展开更多
目的制备MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体,并进行纯化及初步应用,为进一步研制宿主细胞残留蛋白检测试剂盒奠定基础。方法无血清悬浮培养MDCK细胞,采用不同方法(反复冻融、裂解液、超声)裂解细胞获得全细胞蛋白抗原。将抗原与弗氏佐剂...目的制备MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体,并进行纯化及初步应用,为进一步研制宿主细胞残留蛋白检测试剂盒奠定基础。方法无血清悬浮培养MDCK细胞,采用不同方法(反复冻融、裂解液、超声)裂解细胞获得全细胞蛋白抗原。将抗原与弗氏佐剂乳化后经背部多点皮下免疫家兔,间接ELISA法检测血清抗体效价,当抗体效价≥1×106时,经家兔颈动脉采血,获得含多克隆抗体的血清。血清先经硫酸铵盐析粗提,再经DEAE-Sepharose Fast Flow和Protein A精纯,获得多克隆抗体,分析抗体蛋白回收率、纯度及抗原覆盖率。应用制备的多克隆抗体,Western blot法检测MDCK细胞培养流感病毒纯化工艺各阶段样品的宿主细胞残留蛋白。结果采用不同方法裂解细胞与不同离心力制备的抗原无区别,免疫家兔后,血清抗体效价最高可达320 000;纯化后的多克隆抗体纯度> 94%,DEAE-sepharose Fast Flow柱纯化效果优于Protein A柱;MDCK细胞培养流感病毒纯化初期存在较多的宿主细胞蛋白,经多步骤纯化后,单价原液中未见残留蛋白,仅含流感病毒蛋白。结论成功制备了MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体,可定性分析纯化各阶段样品的残留蛋白。展开更多
文摘目的:对CHO宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量检测方法应用于候选治疗性单克隆抗体(以下简称单抗)产品生产过程中质控和放行检测的适用性进行验证。方法:采用荧光标记的二维差异凝胶电泳(2-dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)测定羊抗HCP多克隆抗体对空发酵宿主细胞上清中HCP蛋白的覆盖率;采用统计学方法根据40次检测结果确定检出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ);依照人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)Q2要求验证方法特异性、精密性/中间精密性、准确性、线性和耐受性;依照《美国药典》〈1132〉要求验证方法用于过程中质控的适用性、关键HCP清除步骤和各步骤样品测定稀释度范围。结果:2D-DIGE测定羊抗HCP多抗对CHO HCP的覆盖率为56%,应用该抗体建立的CHO HCP检测方法的LOD和LOQ分别为2.47和7.41 ng·mL^(-1)。经验证,方法特异性、精密性/中间精密性、准确性、线性和耐受性均符合要求。系列稀释单抗纯化过程中间产物,采用选定方法进行检测,确定各生产步骤产物HCP测定的稀释范围,计算各纯化步骤的HCP清除率,确定蛋白A亲和层析为HCP的主要清除步骤。根据上述结果,确定所选定的CHO HCP残留量测定方法可做为蛋白A纯化的过程中控制项目和原液的放行项目。结论:所选定CHO HCP检测方法可应用于候选治疗性单抗的过程中控制和放行。
文摘目的制备MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体,并进行纯化及初步应用,为进一步研制宿主细胞残留蛋白检测试剂盒奠定基础。方法无血清悬浮培养MDCK细胞,采用不同方法(反复冻融、裂解液、超声)裂解细胞获得全细胞蛋白抗原。将抗原与弗氏佐剂乳化后经背部多点皮下免疫家兔,间接ELISA法检测血清抗体效价,当抗体效价≥1×106时,经家兔颈动脉采血,获得含多克隆抗体的血清。血清先经硫酸铵盐析粗提,再经DEAE-Sepharose Fast Flow和Protein A精纯,获得多克隆抗体,分析抗体蛋白回收率、纯度及抗原覆盖率。应用制备的多克隆抗体,Western blot法检测MDCK细胞培养流感病毒纯化工艺各阶段样品的宿主细胞残留蛋白。结果采用不同方法裂解细胞与不同离心力制备的抗原无区别,免疫家兔后,血清抗体效价最高可达320 000;纯化后的多克隆抗体纯度> 94%,DEAE-sepharose Fast Flow柱纯化效果优于Protein A柱;MDCK细胞培养流感病毒纯化初期存在较多的宿主细胞蛋白,经多步骤纯化后,单价原液中未见残留蛋白,仅含流感病毒蛋白。结论成功制备了MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体,可定性分析纯化各阶段样品的残留蛋白。