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生物工程产品中残留宿主DNA检测方法的研究 被引量:1
1
作者 刘耀清 刘志红 +3 位作者 杨景庚 黄文杰 王勇 马立人 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 1997年第3期183-184,共2页
生物工程产品中残留宿主DNA检测方法的研究军事医学科学院放射医学研究所(北京100850)刘耀清刘志红杨景庚黄文杰王勇马立人生物工程产品中残留的宿主细胞DNA是一种潜在的与工艺相关的杂质。各种产品中所含的残留DNA,... 生物工程产品中残留宿主DNA检测方法的研究军事医学科学院放射医学研究所(北京100850)刘耀清刘志红杨景庚黄文杰王勇马立人生物工程产品中残留的宿主细胞DNA是一种潜在的与工艺相关的杂质。各种产品中所含的残留DNA,取决于所用的宿主微生物(细菌或细胞... 展开更多
关键词 生物工程产品 残留宿主 DNA 检测 方法
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对斑点杂交方法检测治疗性单克隆抗体制品中残留宿主细胞DNA含量的影响因素研究 被引量:3
2
作者 张峰 郭玮 +2 位作者 张晶 孟淑芳 王佑春 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期111-115,119,共6页
目的:对斑点杂交方法检测重组生物制品中残留宿主细胞DNA含量试验中的6个影响因素进行评价。方法:对不同的样品稀释液,样品中是否含有蛋白,含蛋白样品是否采用蛋白酶K处理,采用不同方法预处理的模板DNA作为标记用模板,采用不同体积的离... 目的:对斑点杂交方法检测重组生物制品中残留宿主细胞DNA含量试验中的6个影响因素进行评价。方法:对不同的样品稀释液,样品中是否含有蛋白,含蛋白样品是否采用蛋白酶K处理,采用不同方法预处理的模板DNA作为标记用模板,采用不同体积的离心管进行探针标记,分别采用不同的杂交温度,共计6个因素对检测结果的影响进行评价。结果:在使用随机标记的探针通过斑点杂交方法检测重组生物制品中残留宿主细胞DNA含量试验中:标准品和样品稀释中使用水进行稀释时结果可信度较高;样品中含有蛋白会降低检测的灵敏度;在含蛋白样品中加入蛋白酶K处理可以在一定程度上提高检测的灵敏度;使用超声处理的模板DNA作为探针标记的模板时,检测灵敏度较高,同时背景较低;探针标记过程中应采用0.2 mL薄壁PCR管作为容器以保证试验成功率;最适的杂交温度为42℃左右。结论:在斑点杂交方法检测治疗性单克隆抗体制品中残留宿主细胞DNA含量中,采用水作为稀释液,对含蛋白样品使用蛋白酶K消化,标记用模板DNA使用超声处理,使用0.2 mL薄壁PCR管作为标记反应管和在42℃杂交时,结果的稳定性和灵敏度有较大提高。 展开更多
关键词 重组生物制品 单克隆抗体 残留宿主细胞 DNA含量 地高辛标记 斑点杂交法 影响因素
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质谱技术在单克隆抗体类药物宿主细胞残留蛋白检测中的应用进展
3
作者 于继伟 尹红锐 邵泓 《药物流行病学杂志》 CAS 2023年第4期458-465,共8页
单克隆抗体类药物是近年来生物制药领域增长率最快的一类生物技术药物,以其靶向性强、治疗效果明显等优势在癌症、自身免疫性疾病等领域应用广泛。宿主细胞残留蛋白(HCP)是其生产中无法去除且易引起免疫原性的一类工艺杂质,HCP含量测定... 单克隆抗体类药物是近年来生物制药领域增长率最快的一类生物技术药物,以其靶向性强、治疗效果明显等优势在癌症、自身免疫性疾病等领域应用广泛。宿主细胞残留蛋白(HCP)是其生产中无法去除且易引起免疫原性的一类工艺杂质,HCP含量测定是单抗药物质量控制中重要的一项指标。酶联免疫法(ELISA)是目前HCP检测最常用的方法,可以定量检测HCP的总量,但存在局限性。而质谱法作为一种高精密度高准确性的检测方法,已被应用于单克隆抗体类生物药物生产工艺中HCP的监测,可以与ELISA形成互补,弥补ELISA方法存在的不足,为生产条件优化、纯化效果验证提供了依据。文中将从样品前处理技术、分离技术以及数据采集技术3个方面介绍近年来质谱技术在单克隆抗体类药物HCP研究中的应用与进展,为后续质谱法应用于HCP检测研究提供了参考和指导。 展开更多
关键词 单克隆抗体类药物 宿主细胞残留蛋白 质谱 质量控制 检测方法
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实时定量PCR法检测生物技术药物中宿主基因组DNA残留 被引量:9
4
作者 曹晨华 刘晓志 +5 位作者 段月娇 刘素霞 赵伟 常亮 纪丽曼 高健 《生物技术进展》 2014年第2期142-145,共4页
利用基于SYBR GreenⅠ荧光染料的实时定量PCR方法检测酵母表达生物技术药物产品中宿主DNA残留量。该方法检测灵敏度可达到1.0 fg/μL,DNA浓度在1.0 fg/μL^1.0 ng/μL范围内线性良好,其标准曲线的相关系数为0.99以上。应用该方法对3批... 利用基于SYBR GreenⅠ荧光染料的实时定量PCR方法检测酵母表达生物技术药物产品中宿主DNA残留量。该方法检测灵敏度可达到1.0 fg/μL,DNA浓度在1.0 fg/μL^1.0 ng/μL范围内线性良好,其标准曲线的相关系数为0.99以上。应用该方法对3批不同实验样本进行测定,宿主DNA残留量分别为8.635×105fg/μL、6.265×102fg/μL和1.436 fg/μL。实验表明该方法操作简便、灵敏度高,可用于生物技术药物产品中酵母DNA残留的定量测定。 展开更多
关键词 实时定量PCR 宿主基因组DNA残留 生物技术药物 质量控制
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生物制品宿主细胞残留DNA检测限定标准及方法浅析 被引量:8
5
作者 贾惠言 姚雪静 《药学研究》 CAS 2018年第2期115-118,共4页
近年来热度骤增的生物制品药物对诸多疾病疗效斐然,在药品市场中所占比重也是节节攀升。于是生物制品与之俱来的生物安全性问题被渐渐提上日程,其中宿主细胞残留DNA由于可能会传递肿瘤或病毒相关基因,存在潜在的危险性,各国药品监督管... 近年来热度骤增的生物制品药物对诸多疾病疗效斐然,在药品市场中所占比重也是节节攀升。于是生物制品与之俱来的生物安全性问题被渐渐提上日程,其中宿主细胞残留DNA由于可能会传递肿瘤或病毒相关基因,存在潜在的危险性,各国药品监督管理机构对其残留量有着严格的限度控制。同时,各国药典也陆续提供数种关于宿主细胞残留DNA检测经典的方法,目前以实时定量聚合酶链式反应(PCR)方法为最优,因其专一性强、灵敏度高、快速且可实现高通量。本文介绍了一些国内与国外监管机构出台的关于生物制品宿主细胞残留DNA检测的限定规定,并对现有的常见检测方法进行描述、总结和比较。 展开更多
关键词 生物制品 宿主细胞残留DNA 实时定量聚合酶链式反应
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实时定量PCR检测重组生物制品中毕赤酵母基因组DNA的残留量
6
作者 盛灵通 束苏波 孔建龙 《中国药事》 CAS 2016年第12期1283-1288,共6页
目的:建立real-time PCR定量检测毕赤酵母基因组DNA的残留量,提高重组生物制品的产品安全性。方法:以Thermo Fisher Piko Real 96扩增仪平台为基础,选择毕赤酵母GS115的r DNA的5.8s RNA基因为靶基因设计扩增引物,提取酵母基因组DNA,... 目的:建立real-time PCR定量检测毕赤酵母基因组DNA的残留量,提高重组生物制品的产品安全性。方法:以Thermo Fisher Piko Real 96扩增仪平台为基础,选择毕赤酵母GS115的r DNA的5.8s RNA基因为靶基因设计扩增引物,提取酵母基因组DNA,稀释后作为扩增模板,建立实时-PCR定量检测方法,并进行检测限、精密度和回收率等方法学验证,用于重组产品宿主DNA残留的质量控制。结果:该方法检测灵敏度可达0.005 pg·μL-1,DNA浓度在0.005~500 pg·μL-1范围内线性良好,其标准曲线的相关系数为0.99以上。结论:该方法具有操作简便、灵敏度高、可定量等优点,可用于重组产品中毕赤酵母菌残余DNA的定量测定。 展开更多
关键词 实时荧光定量PCR 宿主DNA残留 毕赤酵母 质量控制
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SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法的建立及验证
7
作者 程小玲 施金荣 +4 位作者 张雪婷 申瑷琳 何婧雯 程尧 段凯 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期839-843,共5页
目的 建立严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法,并进行验证,以期更好地控制产品安全性。方法 通过磁珠法对SARS-CoV-2... 目的 建立严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法,并进行验证,以期更好地控制产品安全性。方法 通过磁珠法对SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)原液进行DNA提取,采用探针型PCR对宿主细胞DNA残留量进行定量分析。对建立的方法进行线性范围、重复性、中间精密度、定量限、专属性、耐用性、准确度验证,并使用该方法对5批SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)进行宿主细胞DNA残留量检测。结果 DNA标准曲线在300~0.003 pg/μL范围内线性良好(R~2均≥0.99);重复性和中间精密度验证相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<20%;定量限为0.001 pg/μL;样品稀释液与纯化液稀释液对检测无干扰;样品于53、55、57℃条件下孵育60 min及55℃条件下孵育56、60、64 min的检测结果无明显差异;准确度验证回收率在79%~83%,RSD <5%。用该方法检测SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)原液中DNA残留量适应性良好。结论 成功建立了SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法,该方法线性范围、重复性、中间精密度、定量限、专属性、耐用性和准确度均符合可接受标准,适用于SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量的检测及质量控制。 展开更多
关键词 SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞) 宿主细胞DNA残留 荧光定量PCR
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ELISA试剂盒检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量的验证
8
作者 程小玲 罗敏 +6 位作者 程尧 申瑷琳 郭依依 张娟 李娟娟 施金荣 段凯 《微生物学免疫学进展》 CAS 2023年第5期33-38,共6页
目的验证ELISA试剂盒检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV)中Vero细胞宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量的适用性。方法用同一批ELISA试剂盒检测sIPV中Vero细胞HCP残留量,验证其... 目的验证ELISA试剂盒检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV)中Vero细胞宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量的适用性。方法用同一批ELISA试剂盒检测sIPV中Vero细胞HCP残留量,验证其专属性、重复性、中间精密度、准确度、线性、范围、定量限和耐用性等指标。结果将样品用2种不同稀释液(样品稀释液和疫苗稀释液)稀释后,检测Vero细胞HCP残留量结果均<12.5 ng/mL,表明该方法专属性强;同一检验人员检测同一样品6次,Vero细胞HCP残留量结果均<12.5 ng/mL;不同检验人员检测同一样品6次,Vero细胞HCP残留量结果均<12.5 ng/mL,表明具有良好的重复性和中间精密度;准确度试验中回收率均在99%~106%,CV为2%;在12.5~400.0 ng/mL的线性范围内,标准曲线线性良好(R^(2)>0.98);定量限为50.0 ng/mL;显色时间在25~35 min内对实验无影响,显色温度在36~37℃内对实验无影响,耐用性良好。结论ELISA试剂盒检测sIPV中Vero细胞HCP残留量具有较好的专属性、重复性、中间精密度、准确度、线性和耐用性,可用于sIPV中Vero细胞HCP残留量的检测。 展开更多
关键词 Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗 VERO细胞 宿主细胞蛋白残留 酶联免疫吸附试验 验证
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CHO宿主细胞蛋白残留量检测方法适用性验证 被引量:3
9
作者 张峰 秦俭 +1 位作者 郭莎 王兰 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第21期1967-1974,共8页
目的:对CHO宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量检测方法应用于候选治疗性单克隆抗体(以下简称单抗)产品生产过程中质控和放行检测的适用性进行验证。方法:采用荧光标记的二维差异凝胶电泳(2-dimensional difference gel electro... 目的:对CHO宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量检测方法应用于候选治疗性单克隆抗体(以下简称单抗)产品生产过程中质控和放行检测的适用性进行验证。方法:采用荧光标记的二维差异凝胶电泳(2-dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)测定羊抗HCP多克隆抗体对空发酵宿主细胞上清中HCP蛋白的覆盖率;采用统计学方法根据40次检测结果确定检出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ);依照人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)Q2要求验证方法特异性、精密性/中间精密性、准确性、线性和耐受性;依照《美国药典》〈1132〉要求验证方法用于过程中质控的适用性、关键HCP清除步骤和各步骤样品测定稀释度范围。结果:2D-DIGE测定羊抗HCP多抗对CHO HCP的覆盖率为56%,应用该抗体建立的CHO HCP检测方法的LOD和LOQ分别为2.47和7.41 ng·mL^(-1)。经验证,方法特异性、精密性/中间精密性、准确性、线性和耐受性均符合要求。系列稀释单抗纯化过程中间产物,采用选定方法进行检测,确定各生产步骤产物HCP测定的稀释范围,计算各纯化步骤的HCP清除率,确定蛋白A亲和层析为HCP的主要清除步骤。根据上述结果,确定所选定的CHO HCP残留量测定方法可做为蛋白A纯化的过程中控制项目和原液的放行项目。结论:所选定CHO HCP检测方法可应用于候选治疗性单抗的过程中控制和放行。 展开更多
关键词 宿主细胞蛋白残留 检测 验证 覆盖率 单克隆抗体
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2种定量PCR法与探针杂交法在检测重组白介素1受体拮抗剂中宿主DNA残留量的比较 被引量:2
10
作者 李京敬 郜尽 韩伟 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期140-145,共6页
目的:建立Taqman探针技术的定量PCR方法,对大肠杆菌E.coli/BL21菌株生产的重组白介素1受体拮抗剂(rhIL^-1ra)中的残留宿主DNA进行了定量分析,并与SYBR Green法和地高辛探针杂交法进行比较。方法:以BioRad Chromo 4荧光定量PCR仪... 目的:建立Taqman探针技术的定量PCR方法,对大肠杆菌E.coli/BL21菌株生产的重组白介素1受体拮抗剂(rhIL^-1ra)中的残留宿主DNA进行了定量分析,并与SYBR Green法和地高辛探针杂交法进行比较。方法:以BioRad Chromo 4荧光定量PCR仪为平台,选择大肠杆菌23S核糖体RNA基因为靶基因,设计引物和Taqman探针,以纯化的宿主基因组DNA为标准品,对供试品中残留DNA进行定量。同时在重复性,精密度,检测限等方面与SYBR Green方法和地高辛探针杂交法进行比较。结果:本实验建立的Taqman探针法检测限为0.01 ng·mL^-1,在0.01~1000 ng·mL^-1区间同样具有良好的线性(r=0.997),回收率89.7%~136.0%。测定4批次供试品中残留DNA浓度为0.052、0.092、0.096、0.025 ng·mL^-1。结论:Taqman探针法与SYBR Green法检测灵敏度均达到0.01 ng·mL^-1,在重复性与精密度方面效果一致,且均优于探针杂交方法。 展开更多
关键词 大肠杆菌 定量PCR 宿主残留DNA 重组白介素1受体拮抗剂 质量控制 Taqmen探针
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CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒(PCR-Taqman探针法)的方法学验证 被引量:3
11
作者 吕萍 杨志行 +4 位作者 张慧 宗伟英 吴婉欣 王滔 梁成罡 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第21期2519-2526,共8页
目的:中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)宿主细胞DNA残留检测(PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法:利用磁珠分离法结合Taqman探针定量PCR技术,对自主研制的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行线性与范围、准确度、精密度、专属性... 目的:中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)宿主细胞DNA残留检测(PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法:利用磁珠分离法结合Taqman探针定量PCR技术,对自主研制的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限、参考品DNA标定等验证。特别针对残留定量限、蛋白浓度、pH值、缓冲体系等关键影响因素,以及生产工艺各中间品进行回收率考察,验证试剂盒对复杂样品的检测性能。选取采用不同工艺的多个重组蛋白产品,通过独立三方协作标定,开展试剂盒的适用性研究。结果:DNA标准曲线在3 fg·μL-1~300 pg·μL-1范围内,线性良好(R2> 0. 99);对5个浓度梯度检测的准确度偏差均<10%;定量限为0. 5 fg·μL-1;内部参考品DNA标定结果为10μg·m L-1;精密度良好(RSD≤15%);大鼠、小鼠、大肠杆菌、人类基因组DNA对检测无干扰。另外,对于样品中DNA含量在1pg·m L-1~10 ng·m L-1、pH值在4~9,采用磷酸缓冲体系、Tris缓冲体系、醋酸缓冲体系、柠檬酸缓冲体系等多种基质样品,以及生产工艺中间品的检测回收率均在70%~130%,RSD均<15%。3个独立实验室间协标检测数据RSD均<30%。结论:自主研发CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒(荧光探针法)特异性强、灵敏度高、准确度好,能够满足复杂基质条件下各种重组制品的宿主DNA残留检测要求。 展开更多
关键词 CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒 PCR-Taqman探针法 方法验证
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荧光定量PCR法测定地特胰岛素原料中酿酒酵母宿主DNA残留量 被引量:2
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作者 张晶 周朝东 黄哲甦 《现代药物与临床》 CAS 2020年第7期1312-1315,共4页
目的建立检测地特胰岛素原料中宿主DNA残留量的荧光定量核酸扩增(Real-time PCR)方法并进行验证,用于该产品的质量控制。方法选择酿酒酵母5sRNA作为靶基因设计引物,提取地特胰岛素原料中的残留宿主DNA,采用Real-time PCR SYBRGreen染料... 目的建立检测地特胰岛素原料中宿主DNA残留量的荧光定量核酸扩增(Real-time PCR)方法并进行验证,用于该产品的质量控制。方法选择酿酒酵母5sRNA作为靶基因设计引物,提取地特胰岛素原料中的残留宿主DNA,采用Real-time PCR SYBRGreen染料法对标准DNA和样品进行测定,绘制标准曲线并分析样品中的DNA残留量。对建立的方法进行方法学验证,并测定3批地特胰岛素原料中的残留宿主DNA。结果酿酒酵母基因组DNA质量浓度在0.18~180000 ng/mL线性良好(r^2=0.9985);回收率均在80.0%~106.3%,检测3批地特胰岛素原料的宿主DNA残留量均低于进口药品注册标准限度。结论该方法可用于酿酒酵母生产的地特胰岛素原料中残留宿主DNA的定量测定。 展开更多
关键词 地特胰岛素 酿酒酵母 残留宿主DNA 荧光定量PCR
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定量PCR-Taqman探针法检测NS0宿主细胞残留DNA的方法学验证 被引量:1
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作者 武刚 付志浩 +4 位作者 杨志行 崔永霏 张荣建 宗伟英 王兰 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第24期2001-2009,共9页
目的NS0宿主细胞残留DNA检测(定量PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法针对小鼠骨髓瘤细胞(NS0)基因组重复序列设计合成多对引物、探针,通过实验优选最佳的引物探针组合;应用所建立的前处理试剂盒(磁珠法)对供试品中宿主细胞残留DNA进行... 目的NS0宿主细胞残留DNA检测(定量PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法针对小鼠骨髓瘤细胞(NS0)基因组重复序列设计合成多对引物、探针,通过实验优选最佳的引物探针组合;应用所建立的前处理试剂盒(磁珠法)对供试品中宿主细胞残留DNA进行富集纯化;根据《国际人用药品注册技术协调会(ICH)》及《中国药典》通则9101的要求,应用所建立的NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限的方法学验证。应用NS0细胞生产的单克隆抗体工艺中间品及原液,验证所建立试剂盒对实际生产样品的检测性能,并组织5个独立实验室进行协作标定。结果 NS0细胞DNA检测(Taqman法)正向引物序列:CCCCTTCAGCTCCTTGGGTA、反向引物序列:GCCTGGCAAATACAGAAGTGG、荧光探针序列:FAM-AGGGCCCCCAATGGAGGAGCT-TAMRA;NS0细胞DNA标准曲线在3 fg·μL^-1~300 pg·μL^-1内,线性良好(r2> 0. 99);对6个浓度梯度检测的准确度偏差均<15%;定量限为3 fg·μL^-1;内部参考品DNA标定结果为30μg·m L^-1;精密度良好(RSD≤30%);能特异性地检测NS0细胞DNA,对大肠杆菌DNA、人类基因组DNA(人肾上皮293T细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞DNA无扩增反应。另外,对于生产工艺中间品及原液的检测回收率均在70%~130%,RSD均<15%。5个独立实验室间协标检测数据RSD均<30%。结论自主研发NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒(定量PCR-Taqman探针法)特异性强、灵敏度高、准确度好,能够满足NS0宿主DNA残留检测要求。 展开更多
关键词 NS0 DNA标准品 NS0宿主细胞DNA残留检测 PCR-Taqman探针法 方法验证
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荧光定量PCR法测定重组人/门冬胰岛素原料中宿主DNA的残留量 被引量:1
14
作者 周朝东 苏喆 黄哲甦 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期477-481,共5页
目的:利用wako DNA提取试剂盒结合荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术,建立重组人/门冬胰岛素原料中宿主DNA残留量测定的方法并进行验证,用于对该产品进行质量控制。方法:通过wako DNA提取试剂盒提取重组人/门冬胰岛素原料中的宿主残留DNA... 目的:利用wako DNA提取试剂盒结合荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术,建立重组人/门冬胰岛素原料中宿主DNA残留量测定的方法并进行验证,用于对该产品进行质量控制。方法:通过wako DNA提取试剂盒提取重组人/门冬胰岛素原料中的宿主残留DNA,再利用SYBRGreen染料法对样品和标准DNA进行定量PCR测定,根据标准曲线对样品中的DNA残留量进行分析。对建立的方法进行引物特异性以及结果准确性和精密性验证,同时对本室留样的3批重组人胰岛素原料和3批重组门冬胰岛素原料中的残留DNA进行测定。结果:该方法检测酿酒酵母菌基因组DNA的最低准确定量质量浓度可达0.137 8 ng·mL^(-1),DNA质量浓度在0.137 8~137 800 ng·mL^(-1)范围内,其质量浓度的对数值与Ct值呈良好线性关系,标准曲线的相关系数(r)为0.994;DNA提取试剂盒提取不同量的加标样品回收率均在50%~200%范围内;该方法检测3批重组人胰岛素原料和3批重组门冬胰岛素原料中的DNA残留量均小于10 ng·剂量^(-1),符合进口药品注册标准中关于重组人/门冬胰岛素原料中宿主DNA残留量的要求。结论:wako DNA提取试剂盒能解决重组人/门冬胰岛素原料中样品前处理的技术难点,与定量PCR法结合能够简便、快速、准确地对重组人/门冬胰岛素原料中残留的DNA进行定量测定。 展开更多
关键词 基因工程产品 重组人门冬胰岛素 杂质控制 DNA提取试剂盒 荧光定量PCR 酿酒酵母 宿主菌DNA残留
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特立帕肽宿主DNA残留量检测方法研究
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作者 吕萍 辛中帅 梁成罡 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期668-671,共4页
目的:对特立帕肽宿主DNA残留量进行了方法学研究,为该品种的质控标准提供依据。方法:根据中国药典2010年版三部的方法,分别对10 dose.mL-1和1 dose.mL-1 2个样品浓度的宿主DNA残留量检测进行了方法学研究。结果:研究表明特立帕肽原液2... 目的:对特立帕肽宿主DNA残留量进行了方法学研究,为该品种的质控标准提供依据。方法:根据中国药典2010年版三部的方法,分别对10 dose.mL-1和1 dose.mL-1 2个样品浓度的宿主DNA残留量检测进行了方法学研究。结果:研究表明特立帕肽原液2个浓度的宿主DNA残留检测均符合系统适用性要求。特立帕肽注射液的10 dose.mL-1浓度对加样回收有一定干扰,不能保证加样回收测定均符合规定,而1 dose.mL-1浓度的注射液在10 ng和1 ng的加样回收均没有干扰,因此将1 dose.mL-1样品浓度作为宿主DNA残留量检测浓度。对1 dose.mL-1样品浓度分别进行了1 ng、0.1 ng的加样回收测定,结果均符合要求。对3批特立帕肽原液和注射液检测结果表明每1剂量的宿主DNA残留量均小于10 ng。结论:该方法检测灵敏度较高,特异性较强,操作较安全简便,可用于特立帕肽的质量评价及进口检定。 展开更多
关键词 重组人甲状旁腺激素 特立帕肽 原液 注射液 宿主DNA残留 DNA探针杂交法 方法学研究
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宿主细胞残留蛋白质对单克隆抗体药物质量影响及其质量控制 被引量:5
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作者 刘国芳 刘晓志 +1 位作者 高健 王志明 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期105-111,共7页
以单克隆抗体药物(monoclonal antibodies,mAbs)为代表的生物制品药物销售在不断扩大,并呈现持续上升势头,mAbs的使用为疾病治疗提供了新策略。随着mAbs使用量增大,对产品质量提出了更高要求,随着宿主细胞表达mAbs水平的不断提高,宿主... 以单克隆抗体药物(monoclonal antibodies,mAbs)为代表的生物制品药物销售在不断扩大,并呈现持续上升势头,mAbs的使用为疾病治疗提供了新策略。随着mAbs使用量增大,对产品质量提出了更高要求,随着宿主细胞表达mAbs水平的不断提高,宿主细胞蛋白(host cell proteins,HCP)含量也随之增加,上下游生产工艺面临不断挑战。HCP所含蛋白质异常复杂,虽然一些HCP可能会被降解,但残留HCP仍会引起药物临床使用中的不良反应,从而影响药物的安全性和有效性。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunesorbent assays,ELISAs)是目前HCP检测的重要方法之一,ELISAs可以定量检测药物中总HCP含量,但存在局限性。对正在开发的包括LC-MS/MS在内的多种分析方法进行HCP检测,将为药物工艺过程开发和验证提供更多依据。讨论了以CHO(Chinese hamster ovary,中国仓鼠卵巢)细胞系为宿主的mAbs生产中,HCP的质量控制及检测分析方法的研究进展。 展开更多
关键词 单克隆抗体药物 宿主细胞残留蛋白质 质量控制 检测方法
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阈值法检测人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量 被引量:1
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作者 杨萍 孙博 +5 位作者 刘大维 隋娜 闫慧 张喜珍 谷铁军 张艳 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第7期806-809,共4页
目的建立人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量的阈值检测法,并进行验证。方法验证阈值法的线性范围、准确性及精密度。采用阈值法和DNA探针杂交法分别对3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量进行测定,并进行比较。结果DNA标准品浓度为3~... 目的建立人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量的阈值检测法,并进行验证。方法验证阈值法的线性范围、准确性及精密度。采用阈值法和DNA探针杂交法分别对3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量进行测定,并进行比较。结果DNA标准品浓度为3~200pg时,与检测信号(μV/s)呈良好的线性关系,直线回归方程为y=10.812x-36.761,R^2=0.9945;加入100和25pgDNA标准品的样品回收率为88%~110%,CV分别为7.7%和7.4%;精密度各次检测CV均<10%。阈值法检测3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量分别为181.9、104.2和64.6pg/mL,DNA探针杂交法检测结果分别为约250、约100和<100pg/mL,二者检测结果相符。结论阈值法有望应用于生物制品宿主细胞残留DNA含量的常规检测,且具有良好的准确性及精密度。 展开更多
关键词 阈值法 人用狂犬病疫苗 宿主细胞残留DNA DNA探针杂交法
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宿主细胞残留DNA片段大小分布检测方法的建立及验证 被引量:1
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作者 闫璐瑶 张家友 +5 位作者 张青梅 张哲罡 夏志武 邱冉 刘京 杨晓明 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期335-339,348,共6页
目的建立宿主细胞残留DNA片段大小分布的检测方法,并进行验证,为监控疫苗生产过程提供依据。方法基于高灵敏的微型化芯片毛细管电泳法,用MDCK细胞基因组DNA作为阳性对照品,建立检测方法,并验证方法的检测范围、准确性及精密度。利用建... 目的建立宿主细胞残留DNA片段大小分布的检测方法,并进行验证,为监控疫苗生产过程提供依据。方法基于高灵敏的微型化芯片毛细管电泳法,用MDCK细胞基因组DNA作为阳性对照品,建立检测方法,并验证方法的检测范围、准确性及精密度。利用建立的方法分析MDCK细胞基质流感疫苗生产过程中间品(H1N1型流感病毒收获液、病毒微滤液、核酸酶处理收获液、浓缩病毒液、层析病毒液)残留DNA片段大小分布。结果 MDCK细胞基因组浓度为933.06 ng/μL,A_(260/280)值为2.079,可作为阳性对照。该方法检测范围为35~10 380 bp,精密度检测CV均小于10%。用该方法检测H1N1型流感病毒疫苗中间品,结果显示宿主细胞基因组大片段被核酸酶处理成小片段,层析病毒液300 bp以下片段占总外源DNA的84%。结论建立了一种测定MDCK细胞基质流感疫苗宿主细胞残留DNA片段大小分布的检测方法,该方法精密度良好,有望用于连续细胞系衍生生物制品的原液检定和质量控制。 展开更多
关键词 宿主细胞残留DNA 片段大小 分布 毛细管电泳
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MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体的制备、纯化及初步应用 被引量:2
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作者 尹金良 徐文 +6 位作者 郭占龙 郭丹丹 姚为民 赵大鹏 张雪梅 常军亮 吴业红 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期176-180,191,共6页
目的制备MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体,并进行纯化及初步应用,为进一步研制宿主细胞残留蛋白检测试剂盒奠定基础。方法无血清悬浮培养MDCK细胞,采用不同方法(反复冻融、裂解液、超声)裂解细胞获得全细胞蛋白抗原。将抗原与弗氏佐剂... 目的制备MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体,并进行纯化及初步应用,为进一步研制宿主细胞残留蛋白检测试剂盒奠定基础。方法无血清悬浮培养MDCK细胞,采用不同方法(反复冻融、裂解液、超声)裂解细胞获得全细胞蛋白抗原。将抗原与弗氏佐剂乳化后经背部多点皮下免疫家兔,间接ELISA法检测血清抗体效价,当抗体效价≥1×106时,经家兔颈动脉采血,获得含多克隆抗体的血清。血清先经硫酸铵盐析粗提,再经DEAE-Sepharose Fast Flow和Protein A精纯,获得多克隆抗体,分析抗体蛋白回收率、纯度及抗原覆盖率。应用制备的多克隆抗体,Western blot法检测MDCK细胞培养流感病毒纯化工艺各阶段样品的宿主细胞残留蛋白。结果采用不同方法裂解细胞与不同离心力制备的抗原无区别,免疫家兔后,血清抗体效价最高可达320 000;纯化后的多克隆抗体纯度> 94%,DEAE-sepharose Fast Flow柱纯化效果优于Protein A柱;MDCK细胞培养流感病毒纯化初期存在较多的宿主细胞蛋白,经多步骤纯化后,单价原液中未见残留蛋白,仅含流感病毒蛋白。结论成功制备了MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体,可定性分析纯化各阶段样品的残留蛋白。 展开更多
关键词 MDCK宿主细胞残留蛋白 多克隆抗体 纯化 DEAE-sepharose Fast Flow Protein A
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基因工程药物质控方法(ELISA和HPLC)研究及应用
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作者 汤昌国 梁成罡 《生命科学仪器》 2006年第4期16-26,共11页
目的:1.建立适用于重组人生长激素(rh-GH)生产质量控制的大肠杆菌蛋白残留(ECP)测定方法。2.完成对重组人激素H1(rh-H1)的重要质量控制项目:含量、纯度、肽图的检定。方法:采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)对rh-GH产品中的ECP残留... 目的:1.建立适用于重组人生长激素(rh-GH)生产质量控制的大肠杆菌蛋白残留(ECP)测定方法。2.完成对重组人激素H1(rh-H1)的重要质量控制项目:含量、纯度、肽图的检定。方法:采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)对rh-GH产品中的ECP残留进行检测,并按照中国药典、生物制品规程及ICH有关要求进行方法学验证。采用反相高效液相色谱法对rh-H1进行了含量测定、纯度检查和肽图分析。结果:1.根据研究所得真实可靠的方法学评价结果,建立并规范了可用于rh-GH常规生产工艺控制的宿主蛋白残留检测方法。2.对三批rh-H1原液检定结果分别为,含量:100.5%、101.1%、99.8%;纯度:98.0%、98.4%、97.8%;肽图:三批原液肽图均与对照品一致。表明该产品的此三项指标均符合规定。 展开更多
关键词 ELISA HPLC 宿主蛋白残留 质量控制 基因工程药物
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