沉默微小RNA-378靶向调节骨形态发生蛋白2/母亲DPP同源物4信号通路对大鼠胫骨骨折愈合的影响实验研究

目的:探究沉默微小RNA-378(miR-378)靶向调节骨形态发生蛋白(BMP)2/母亲DPP同源物(Smad)4信号通路对大鼠胫骨骨折愈合的影响。方法:对38只大鼠建立胫骨骨折模型,另取18只正常大鼠作为假手术组。选取胫骨骨折模型造模成功大鼠中的8只作为造模组,假手术组中的8只作为对照组。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测造模组胫骨骨折部位骨组织及对照组相同部位正常骨组织miR-378与BMP2、Smad4 mRNA表达。将30只胫骨骨折模型大鼠随机分为模型组、空载质粒组和miR-378沉默组,每组10只。空载质粒组、miR-378沉默组分别经尾静脉注射1μg空载质粒或miR-378小干扰RNA(siRNA)质粒;模型组和剩余10只假手术组大鼠经尾静脉注射0.9%氯化钠溶液1μg;每2天注射1次,连续干预30 d。利用X线观察各组大鼠胫骨骨折愈合情况并进行骨折愈合评分(Lane-Sandhu评分)。采用酶联免疫吸附法检测各组血清炎症因子和骨钙素(OC)、碱性磷酸酶(ALP)水平。采用HE染色观察各组骨组织形态学变化。采用RT-qPCR检测各组骨组织miR-378与BMP2、Smad4 mRNA表达。采用蛋白印迹检测各组骨组织BMP2、Smad4蛋白表达。结果:造模组骨组织miR-378表达水平高于对照组,BMP2、Smad4 mRNA表达水平低于对照组(均P<0.05)。假手术组大鼠骨组织结构清晰;模型组和空载质粒组骨折线清晰,无骨痂出现,骨组织结构严重破坏,仅有少量成骨细胞生成;miR-378沉默组骨折线模糊,出现骨痂,骨组织破坏程度得到缓解并有大量成骨细胞生成。与假手术组比较,模型组血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、OC、ALP及骨组织miR-378表达水平升高,BMP2、Smad4 mRNA和蛋白表达水平降低(均P<0.05)。与模型组和空载质粒组比较,miR-378沉默组Lane-Sandhu评分、OC、ALP水平,以及BMP2、Smad4 mRNA和蛋白表达水平升高,血清TNF-α、IL-1β及骨组织miR-378表达水平降低(均P<0.05)。结论:沉默miR-378可能通过靶向激活BMP2/Smad4信号通路减轻胫骨骨折大鼠炎症反应,促进成骨细胞生成,加快大鼠骨折部位的愈合。

急性冠状动脉综合征患者血清糖原合成酶激酶-3β和母亲DPP同源物4的表达及临床意义

目的探讨急性冠状动脉综合征(ACS)患者血清糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和母亲DPP同源物4(SMAD4)表达水平与冠状动脉病变程度和预后的关系。方法回顾性选取2020年6月至2022年5月山东第一医科大学附属青岛医院收治的192例ACS患者为ACS组,同期收治的192例非ACS患者为非ACS组。通过酶联免疫吸附法测定两组患者血清GSK-3β、SMAD4表达水平。采用Gensini积分系统评价患者冠状动脉病变程度,并采用Spearman法分析ACS患者血清GSK-3β、SMAD4表达水平与Gensini总积分的相关性。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清GSK-3β、SMAD4水平对ACS患者预后的预测效能。结果ACS组患者血清GSK-3β、SMAD4水平均高于非ACS组[(2.70±0.40)μg/L比(2.24±0.41)μg/L、(12.19±2.10)μg/L比(9.79±2.82)μg/L],差异有统计学意义(P<0.05)。轻度、中度、重度冠状动脉病变ACS患者血清GSK-3β、SMAD4水平均依次升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Spearman分析结果显示,ACS患者血清GSK-3β、SMAD4水平均与Gensini总积分呈正相关(r=0.569、0.587,P<0.01)。ACS患者预后不良48例,预后不良发生率为25.00%(48/192);预后良好144例。预后不良ACS患者血清GSK-3β、SMAD4水平均高于预后良好ACS患者[(3.15±0.53)μg/L比(2.55±0.36)μg/L、(14.03±2.08)μg/L比(11.58±2.11)μg/L],差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清GSK-3β、SMAD4水平单独与联合预测ACS患者预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.799、0.784、0.858,二者联合预测的AUC显著高于单独预测的AUC(Z=2.04和2.75,P=0.041和0.006)。结论ACS患者血清GSK-3β、SMAD4表达异常升高,二者与ACS患者冠状动脉病变程度正相关,均对ACS患者不良预后有良好预测效能,且二者联合运用的预测效能更好。

白花蛇舌草醇提物对矽肺大鼠肺组织TGF-β1、Smad、MMP-2表达的影响

目的探究白花蛇舌草醇提物对矽肺大鼠肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、母亲DPP同源物(Smad)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响。方法以气管内滴注二氧化硅混悬液的方法构建矽肺大鼠模型60只,随机分为模型组、白花蛇舌草醇提物低(1.5 g/kg)、中(3 g/kg)、高(6 g/kg)剂量组、吡非尼酮(100 mg/kg)组,每组12只,另选取12只大鼠气管内滴注等剂量生理盐水作为对照组。采用药物干预后,检测大鼠肺功能,比较其指标:每分通气量(MV)、呼气峰流值(PEF)、吸气阻力(Ri);检测各组大鼠双肺质量及其脏器系数;免疫组织化学染色检测各组大鼠肺组织淋巴细胞浸润情况,比较各组淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)阳性细胞比例;天狼星红染色检测各组大鼠肺组织胶原沉积及纤维化变性情况,比较胶原容积分数(CVF);采用试剂盒检测大鼠血清白细胞介素-18(IL-18)、环氧化酶-2(COX-2)、TGF-β1水平;蛋白免疫印迹法检测大鼠肺组织TGF-β1、Smad、MMP-2蛋白表达情况。结果与对照组相比,模型组大鼠MV、PEF显著降低,Ri、双肺质量及其脏器系数、肺组织LFA-1阳性细胞比例、CVF、血清IL-18、COX-2及TGF-β1水平、肺组织TGF-β1、Smad及MMP-2蛋白表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,白花蛇舌草醇提物低、中、高剂量组和吡非尼酮组大鼠MV、PEF均升高,Ri、双肺质量及其脏器系数、肺组织LFA-1阳性细胞比例、CVF、血清IL-18、COX-2及TGF-β1水平、肺组织TGF-β1、Smad及MMP-2蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(P<0.05),且白花蛇舌草醇提物随剂量升高而作用增强并呈剂量依赖性(P<0.05)。白花蛇舌草醇提物高剂量组与吡非尼酮组相比,大鼠各指标水平无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。结论白花蛇舌草醇提物可抑制肺组织TGF-β1、Smad、MMP-2表达,降低矽肺大鼠炎性因子水平,减轻肺组织炎症反应损伤和纤维化变性,修复肺功能。

川芎嗪对胶质瘤干细胞裸鼠皮下移植瘤生长、TGF-β信号通路和上皮-间质转化的影响

目的:探讨川芎嗪对胶质瘤干细胞(GSCs)裸鼠皮下移植瘤生长、转化生长因子β(TGF-β)信号通路和上皮-间质转化(EMT)的影响,为胶质瘤临床治疗药物的选择提供参考。方法:收集人脑胶质瘤细胞系U87细胞,培养、分离、富集并鉴定GSCs。40只雌性BALB/c裸鼠,建立GSCs裸鼠皮下移植瘤模型,成模后随机分为模型组和低、中及高剂量川芎嗪组,每组10只。低、中和高剂量川芎嗪组裸鼠每3 d腹腔注射给药1次,给药剂量分别为1.5、3.0和6.0 mg·kg^(-1),模型组裸鼠仅腹腔注射等量生理盐水,连续15 d。测量各组裸鼠移植瘤体积,称瘤质量,计算瘤质量抑制率,绘制肿瘤生长曲线。HE染色观察各组裸鼠肿瘤组织病理形态表现,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组裸鼠肿瘤组织中TGF-β1和TGF-β受体Ⅰ(TβRⅠ)mRNA表达水平,Western blotting法检测各组裸鼠肿瘤组织中TGF-β1、TβRⅠ、母亲DPP同源物2/3(Smad2/3)、磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、TWIST家族bHLH转录因子1 (TWIST1)、波形蛋白(Vimentin)及锌指蛋白(Snail)表达水平。结果:在U87细胞中成功富集并分离获得GSCs,免疫荧光染色可见干细胞标志物CD133阳性表达。与模型组比较,低、中和高剂量川芎嗪组裸鼠移植瘤体积均减小(P<0.05),且呈剂量依赖性;移植瘤质量均降低(P<0.05),且呈剂量依赖性;低、中和高剂量川芎嗪组瘤质量抑制率逐渐增大,分别为12.72%、39.90%和55.36%。HE染色观察,模型组裸鼠肿瘤组织细胞形态良好,连接紧密,生长密度高,核异型性明显;低、中和高剂量川芎嗪组裸鼠肿瘤组织结构紊乱,细胞密度逐渐降低,核固缩和核裂解逐渐明显,组织坏死区逐渐增大,且随着川芎嗪剂量的增加,上述改善逐渐明显。RT-qRCR法检测,与模型组比较,低、中和高剂量川芎嗪组裸鼠移植瘤组织中TGF-β1和TβRⅠmRNA表达水平均降低(P<0.05),且呈剂量依赖性。Western blotting法检测,与模型组比较,低、中和高剂量川芎嗪组裸鼠皮下移植瘤组织中E-cadherin蛋白表达水平均升高(P<0.05),TWIST1、Vimentin、Snail、TGF-β1、TβRⅠ和p-Smad2/3蛋白表达水平均降低(P<0.05),且呈剂量依赖性。结论:川芎嗪可发挥对GSCs裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,同时可干扰TGF-β1/Smad2/3信号激活和EMT诱导。

沉默miR-216a对四氯化碳诱导的肝纤维化模型大鼠的保护作用及机制研究

目的探究沉默miR-216a对四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化模型大鼠的作用及机制。方法从50只大鼠中随机选取10只作为正常组,其余40只采用腹腔注射含CCl4的橄榄油溶液方法构建肝纤维化模型大鼠。将造模成功的30只大鼠随机分为模型组、对照组和沉默组,每组各10只,对照组尾静脉注射含空载质粒的腺病毒,沉默组尾静脉注射含si-miR-216a质粒的腺病毒。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(ⅣC)的表达水平。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time qPCR)法检测miR-216a、第10号染色体缺失性磷酸酶及张力蛋白同源物基因(PTEN)mRNA和母亲DPP同源物7(Samd7)mRNA的相对表达量。采用蛋白质印迹法检测PTEN和Samd7的表达水平。结果与正常组比较,模型组HA、LN、PCⅢ、ⅣC和miR-216a表达水平均升高,而PTEN mRNA、Samd7 mRNA、PTEN和Samd7的表达水平均降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。与模型组和对照组比较,沉默组HA、LN、PCⅢ、ⅣC和miR-216a表达水平均降低,而PTEN mRNA、Samd7 mRNA、PTEN和Samd7表达水平均升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论沉默miR-216a可降低肝纤维化大鼠HA、LN、PCⅢ和ⅣC的表达水平,改善CCl4诱导的肝纤维化损伤,其机制可能与调控PTEN/Smad7信号通路有关。

声带白斑组织SMAD4、IL-35的表达及其与喉癌的关系研究

目的分析声带白斑组织果蝇母亲DPP同源物4(SMAD4)、IL-35表达情况,并探讨其与喉癌的关系。方法选取2019年1月至2021年1月嘉兴市第一医院耳鼻咽喉科收治的行手术治疗的声带白斑患者30例为声带白斑组,声带息肉患者30例为声带息肉组,喉癌患者30例为喉癌组,采用RT-PCR法、免疫荧光染色法检测声带息肉组织、白斑组织及喉癌组织SMAD4、IL-35(包括2个亚型:IL-12p35、Ebi3)mRNA和蛋白的表达情况;分析声带组织SMAD4 mRNA表达水平、蛋白阳性表达率与上皮异常增生程度的相关性;分析声带白斑患者术后发展为喉癌的危险因素;分析影响喉癌患者预后的危险因素。结果声带息肉组织SMAD4 mRNA表达水平、蛋白阳性表达率>声带白斑组织>喉癌组织(均P<0.05),声带息肉组织IL-12p35与Ebi3 mRNA表达水平、蛋白阳性表达率<声带白斑组织<喉癌组织(均P<0.05)。声带组织SMAD4 mRNA表达水平、蛋白阳性表达率与声带组织上皮异常增生程度均呈负相关(r_(s)=-0.637、-0.817,均P<0.05);IL-12p35 mRNA表达水平、蛋白阳性表达率与声带组织上皮异常增生程度均呈正相关(r_(s)=0.712、0.673,均P<0.05);Ebi3 mRNA表达水平、蛋白阳性表达率与声带组织上皮异常增生程度均呈正相关(r_(s)=0.681、0.776,均P<0.05)。Cox多因素分析显示,声带白斑形态分型差、上皮异常增生程度高、SMAD4低表达及Ebi3高表达是声带白斑患者术后发展为喉癌的独立危险因素(均P<0.05);淋巴结转移及IL-35高表达是影响喉癌患者预后的独立危险因素(均P<0.05)。结论SMAD4与IL-35的表达变化可能是喉癌发生、发展的早期事件,SMAD4低表达及IL-35高表达可能通过影响信号通路或免疫抑制影响声带白斑的转归,两者或可作为评估声带白斑患者转归及喉癌患者预后的指标。

羊栖菜多糖对2型糖尿病大鼠肾脏保护作用及其机制

目的研究羊栖菜多糖(Sargassumfusi forme polysaccharide,SFPS)对2型糖尿病大鼠肾脏保护作用及其机制。方法将Wistar大鼠经链脲佐菌素造2型糖尿病大鼠模型,试验组给予SFPS 1.6,0.8和0.4 g.kg-1.d-1,灌胃治疗4 w。12 w后,观察肾功能、尿蛋白、肾脏病理变化。并以逆转录PCR检测肾脏转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)及母亲DPP同源物7(mothers against decapentaplegichomolog 7,Smad 7)的表达。结果 SFPS能显著改善肾脏功能。模型组大鼠肾脏TGF-β1和Smad 7 mRNA表达显著升高(P<0.01),而SFPS试验组TGF-β1和Smad 7 mRNA表达显著降低(P<0.01)。结论 SFPS对糖尿病大鼠肾组织有明显保护作用,其机制可能通过抑制肾脏TGF-β1和Smad 7 mRNA的表达。

电磁场干预对异位骨化大鼠模型的抗异位骨化效应及机制探讨

目的观察电磁场干预对异位骨化(HO)大鼠模型的抗异位骨化效应并探讨相关作用机制。方法采用随机数字表法将72只雄性SD大鼠分为对照组、模型组及观察组。采用钳夹、切断跟腱等方式将模型组、观察组大鼠制成HO动物模型,对照组术中仅暴露跟腱组织,未给予钳夹、切断处理。观察组大鼠于制模后每天给予2次50 Hz、1 mT正弦交变电磁场暴露干预,每次持续2 h。于术后3 d、14 d、1个月及3个月时每组各取6只大鼠,提取跟腱组织进行大体、组织学及免疫组化染色观察,并采用Western blot或RT-PCR方法检测标本中母亲DPP同源物7(Smad7)、母亲DPP同源物3(Smad3)、磷酸化母亲DPP同源物3(p-Smad3)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)及组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)等蛋白或基因表达情况;于术后1个月、3个月时对各组大鼠患肢跟腱部位进行X线检查以了解异位骨化形成情况。结果术后各时间点对照组大鼠各项检测指标(包括跟腱大体外观、HE染色、免疫组化染色以及X线检查等)均无明显变化;与模型组比较,观察组异位骨化形成被明显抑制。模型组及观察组MMP-9基因表达量均显著高于对照组(P<0.05),且随时间延长呈上升趋势;TIMP-1基因表达量均显著低于对照组(P<0.05),且随时间延长呈下降趋势。与模型组比较,观察组术后各时间点MMP-9表达量均明显降低(P<0.05),TIMP-1表达量均明显升高(P<0.05)。与模型组比较,观察组术后各时间点Smad7蛋白含量均明显增加,p-Smad3蛋白含量均明显减少。结论50 Hz、1 mT正弦交变电磁场干预对HO大鼠模型具有明确的抗异位骨化效应,其作用机制可能与促进Smad7表达,阻止Smad3磷酸化,从而抑制转化生长因子-β(TGF-β)/Smad信号转导通路,促进MMP-9/TIMP-1重新恢复动态平衡有关。